Индукция и мониторинг приемных гиперчувствительности замедленного типа у крыс

Меня зовут Кристин Битон. Я младший научный сотрудник в лаборатории Джорджа Чена на кафедре физиологии и биофизики Калифорнийского университета в Ирвайне. В ближайшие несколько дней я продемонстрирую вам процедуру индуцирования и измерения адаптивной РЗГ у крыс линии Louis.

Данная процедура занимает пять дней. Я продемонстрирую вам, как активировать антигенспецифические Т-клетки, затем, спустя два дня, ввести их интрадермально наивным крысам. Снова через два дня мы введем крысам в уши антиген, к которому специфичны эти Т-клетки. Затем, через день, мы измерим степень воспаления у этих крыс.

Для получения сыворотки для культур тканей мне необходимо взять кровь. Для этого я выполняю пункцию сердца. Я помещаю указательный палец левой руки на солнечное сплетение, вывожу иглу к сердцу через межреберное пространство и аспирирую максимально возможный объем крови.

За один забор, в зависимости от дня и эффективности, мы можем получить от 2 до 10 мл крови от одной крысы. Сыворотка необходима нам для культивирования клеток крыс линии Louis; использование сыворотки этой же линии обеспечивает сингенность. Таким образом, нам потребуется сыворотка крыс линии Louis.

Затем я переношу кровь в пробирку, стараясь предварительно извлечь иглу из шприца, чтобы избежать гемолиза, так как сыворотка понадобится мне позже для культивирования тканей. Теперь я приступлю к извлечению тимуса, поскольку сердце перестало биться и крыса мертва.

Сначала я обрабатываю поверхность 70% ethanol, чтобы исключить попадание шерсти в орган, так как он необходим мне для культивирования тканей. Для проведения диссекции я использую автоклавированные инструменты. Первым делом я удаляю кожу.

После удаления кожи я аккуратно делаю разрезы по обеим сторонам грудной клетки, чтобы не повредить тимус, расположенный непосредственно над сердцем. Тимус виден здесь как бледный, почти белый орган, находящийся прямо над сердцем. Я извлекаю его, стараясь забрать орган целиком, но не слишком стремлюсь к идеальной чистоте извлечения, так как позже я очищу его в вытяжном шкафу.

Затем я просто помещаю его в пробирку с PBS, содержащим пенициллин и стрептомицин. Чтобы предотвратить рост бактерий, теперь я приготовлю суспензию одиночных клеток цитов. Для этого я буду использовать клеточный фильтр с размером пор 70 мкм.

Разумеется, я буду использовать только стерильное оборудование. Я переношу тимус в чашку Петри. Как видите, он недостаточно очищен.

Тимус представляет собой беловатый орган, на котором видны лимфатические узлы и сгустки крови. Я удалю их. Также я помещу около 10 мл PBS с добавлением антибиотиков в сепаратор клеток, чтобы подготовить его к приему очищенного тимуса.

Таким образом, для очистки я просто удаляю все загрязнения из тимуса. Теперь мой тимус почти полностью очищен, поэтому я захвачу его пинцетом и разрежу ножницами на мелкие кусочки над селл-трейнером, помещая все мелкие фрагменты тимуса внутрь селл-трейнера. После этого я воспользуюсь поршнем стерильного одномиллилитрового шприца, чтобы создать суспензию одиночных клеток, пропуская кусочки тимуса через селл-трейнер.

Теперь отдельные клетки пройдут сквозь фильтр и окажутся в PBS по внешней стороне селл-трейнера. Я пропустил клетки через селл-трейнер, и теперь видно, что PBS перестал быть прозрачным. Он заполнен суспензией одиночных клеток, которую я перенесу в пробирку объемом 50 мл, находящуюся на льду.

Я повторю эту процедуру несколько раз, снова наполняя сеточный фильтр для клеток PBS, нажимая на поршень шприца и перенося жидкость в пробирку, пока в ней не окажется от 30 до 40 мл PBS. Вот так выглядит сеточный фильтр после завершения процесса. Теперь, когда все клетки собраны, я центрифугирую их в течение примерно 10 минут при 1200 RPM.

Перед вами клетки, которые я достал из центрифуги; осадок довольно большой, что ожидаемо, так как сейчас я избавляюсь от супернатанта. Осадок, разумеется, остается на дне пробирки. Чтобы облегчить процесс создания суспензии, я разломаю этот осадок, пока он еще почти сухой.

Для этого я просто с силой постукиваю по нему пальцем до тех пор, пока не увижу, что ПТ полностью дезагрегирован и мы снова получили суспензию из отдельных клеток. Теперь я ресуспендирую клетки в стерильном PBS, добавляя 5 мл PBS на один таймер. Поскольку у меня всего один таймер, я добавляю 5 мл.

Эту суспензию я перенесу в ирригатор. Для ирригации я использую температуру 30 °C, чтобы клетки оставались живыми, но погибли в течение нескольких часов. Таким образом, они смогут переработать антиген, но не загрязнят мою культуру.

Если мы посмотрим на Т-клетки, которые хотим активировать, то увидим, что они совсем не выглядят здоровыми. Некоторые начали погибать. У них странная форма, они больше не обнаруживаются.

Таким образом, эти клетки готовы к активации. После определенного времени ожидания они фактически остро нуждаются в антигене. Крайне важно быстро промыть их, так как часть клеток погибнет и выделит в раствор токсичные соединения.

Затем я дополняю объем в пробирке раствором PBS до 50 мл. Одновременно с этим я переношу T-клетки, ожидающие стимуляции, в другую пробирку объемом 50 мл, чтобы иметь возможность центрифугировать обе пробирки одновременно.

Перед нами кровь, которую я собрал некоторое время назад; я выдержал её в течение 10 минут при 37 °C, а затем поместил на лёд. Как видите, она полностью свернулась. Теперь мне необходимо выделить сыворотку из этой крови.

Для сбора на первом этапе с помощью стерильной пастеровской пипетки я отделю сгусток от стенки пробирки и соберу всю жидкость, содержащую интересующую меня сыворотку, а также некоторые клетки, которые не были захвачены сгустком. Затем я перенесу эту жидкость в другую пробирку; при переносе иногда попадают небольшие частицы сгустка, но это не является проблемой, так как мне в любом случае необходимо удалить клетки, все еще находящиеся в этой жидкости.

Теперь я помещу микропробирку с жидкостью в центрифугу. Это позволит удалить клетки и любые фрагменты сгустков. Я центрифугирую жидкую часть крови, чтобы отделить форменные элементы от сыворотки. Для этого будет достаточно центрифугирования в течение двух минут.

Теперь, когда сыворотка была центрифугирована, я отделю её от клеток. Это не идеальный пример, так как сыворотка должна быть желтоватой, а данная имеет красноватый оттенок, что указывает на гемолиз. Несмотря на это, я всё равно продемонстрирую вам способ её фильтрации.

Я использую шприц с адаптерным фильтром с порами 0,2 micron, чтобы отфильтровать сыворотку и убедиться в ее стерильности. Однако из-за того, что произошел гемолиз, я не буду использовать данную партию сыворотки для стимуляции. Я буду использовать сыворотку крыс линии Louis, которая была заморожена во время предыдущего эксперимента.

Слева находятся центрифугированные осадки Т-клеток, а справа — антигенпрезентирующих клеток. Сейчас я удалю супернатант из обеих пробирок. Как и ранее, я разобью осадки, постучав по ним пальцем, чтобы клетки снова образовали суспензию из отдельных клеток.

Я проделаю это для обоих типов клеток: Т-клеток и антигенпрезентирующих клеток. После этого я суспендирую их и проведу подсчет. Затем я смешаю 3 миллиона Т-клеток со 150 миллионами антигенпрезентирующих клеток и помещу их в чашки Петри диаметром 10 сантиметров.

При общем объеме 10 мл здесь представлены две пробирки с сывороткой. Справа — та, которую я подготовила сегодня; она имеет красноватый оттенок из-за гемолиза, в то время как слева находится пробирка, подготовленная несколько дней назад и хранившаяся в замороженном виде. Она желтоватая, без признаков гемолиза, и выглядит гораздо лучше.

Именно его я буду использовать сегодня для культивирования тканей. У меня достаточно клеток, чтобы подготовить шесть чашек Петри, поэтому я добавлю по 30 мл среды в пробирки с антигенпрезентирующими клетками и в пробирки с T-клетками. Затем в пробирку с антигенпрезентирующими клетками я добавлю антиген, которым в данном случае является альбумин.

Таким образом, концентрация моего стокового раствора составляет 1 mg/ml, и я хочу получить конечную концентрацию в чашках Петри 10 µg/ml. В среду для Т-клеток я добавлю сыворотку крыс линии Lewis. Я добавлю достаточное количество, чтобы в итоге в чашках Петри содержание сыворотки крыс составило 1%.

Я собираюсь гомогенизировать суспензию антигенпрезентирующих клеток, а затем перенести по 5 мл этой клеточной суспензии в каждую чашку Петри. Когда вы будете доставать суспензию антигенпрезентирующих клеток, вы заметите, что всегда присутствует небольшой комочек жировой и фиброзной ткани. Это абсолютно нормально.

Это происходит на всех этапах подготовки образцов. Беспокоиться об этом не стоит. Поэтому я либо удаляю это, если получается, либо оставляю в чашке Петри.

Это совершенно не влияет на мою клеточную культуру. Как только я перенесу все антигенпрезентирующие клетки (APC) в чашки Петри, я повторю эту процедуру с T-клетками. Таким образом, я добавлю по 5 mL суспензии T-клеток в каждую из этих чашек Петри.

Теперь все мои клетки находятся в чашках Петри, и очень важно тщательно их перемешать, чтобы все T-клетки имели возможность вступить в контакт с антигенпрезентирующей клеткой. Для этого я складываю чашки Петри стопкой и перемешиваю содержимое, описывая ими невидимые восьмерки. Я повторяю это несколько раз, чтобы убедиться, что все клетки хорошо перемешаны.

После завершения всего перемешивания я помещу эти чашки в инкубатор с влажной атмосферой при 37 °C и 5% CO2. Они будут находиться в инкубаторе в течение 48 часов. Цвет среды немного изменился, теперь она более оранжевая, и клетки были успешно активированы.

Я последовательно проверяю все чашки Петри под микроскопом. Очень крупные клетки представляют собой активированные Т-клетки, а очень маленькие — погибшие антигенпрезентирующие клетки. Стимуляция прошла успешно, так как видно, что Т-клетки значительно увеличились в размере.

Если я немного перемещу чашку Петри — ой, вот видите здесь, слева, а теперь в центре, есть большой комок клеток, и это активно делящиеся клетки. Теперь я перенесу все клетки в центрифужные пробирки, чтобы осадить их, подсчитать и затем ввести по 10 миллионов клеток крысам. Стимуляция была настолько эффективной, что мне не нужны все эти T-клетки для введения одной крысе.

Таким образом, я буду использовать клетки только из двух чашек Петри. Я центрифугирую их, чтобы отобрать 10 миллионов клеток, а остальные клетки помещу в культуру для последующей заморозки через несколько дней.

В качестве культуральной среды используется стандартная среда для культивирования Т-клеток с добавлением фактора роста Т-клеток и сыворотки лошади. Поскольку Т-клетки являются неадгезивными, особых действий не требуется; достаточно убедиться, что большая часть клеток перенесена вместе со средой.

Затем в конце я промою все чашки Петри новой средой, чтобы убедиться, что я извлек все клетки. Использую 10 мл среды, той же, что и для стимуляции; я полагаю, что из каждой чашки Т-клетки уже вышли при первом сборе среды. Обычно среда выходит из чашек полностью, и это не является абсолютно обязательным, но поскольку эти клетки очень ценны, я не хочу потерять ни одной.

Поэтому я центрифугирую их. Это позволит удалить часть погибших клеток и начать работу преимущественно с живыми клетками. Также я хочу заменить среду на свежую.

Теперь я снова центрифугирую образцы при 1 500 RPM в течение примерно восьми минут. Тормоз остается включенным, так как мне нужно лишь осадить клетки. Теперь мы аккуратно сливаем супернатант из обеих пробирок, и в одной из них я вижу небольшие осадки.

Это получено из двух чашек Петри. А здесь осадок из четырех чашек Петри. Осадки очень крупные, так как они содержат не только активированные T-клетки, но и антигенпрезентирующие клетки.

Теперь я удалю супернатант и в клетки, которые буду инъецировать, добавлю 1 ml среды — именно ее я буду использовать для инъекции. Остальные клетки я суспендирую в 100 µL культуральной среды с фактором роста Т-клеток и сывороткой лошади. Таким образом, это те клетки, которые я буду инъецировать.

Эти клетки я распределю по двум пластиковым флаконам объемом 50 мл каждый. В каждый флакон я добавлю 10% фактора роста Т-клеток костного мозга, а также 10% термоинактивированной сыворотки лошади.

Затем я добавлю большую часть необходимой среды. Я не буду многократно перемещать жидкость пипеткой, так как Т-клетки чувствительны к избыточному пипетированию. Поэтому я использую пипетку лишь для перемещения минимально необходимых объемов, после чего завершаю процесс, и они готовы.

Они готовы к помещению в инкубатор, я проверяю их ежедневно. Вероятно, мне потребуется рассадить их через 24 часа, если не через 40, то уж точно через 48 часов. Но я буду проверять их каждый день.

Они имеют тенденцию к очень быстрому росту в присутствии фактора роста Т-клеток. Поэтому их необходимо пересевать не реже чем каждые 48 часов, а возможно, и чаще. Также я проверю цвет питательной среды.

Теперь они активированы, то есть полностью активированы. Это лучшее время для их введения крысе. Через два дня мы проведем тест на гиперчувствительность в ухе крысы.

Если мы подождем пару дней, пока клетки вернутся в состояние покоя, они так быстро не вернутся к месту воспаления. Поэтому сейчас я помещу их в инкубатор при 37 °C с 5% CO2, а для инъекции крысе буду использовать иглу 25-го калибра. Теперь, когда клетки введены внутрибрюшинно, я оставлю крысу здесь и через 48 часов проведу провокационную пробу на ушах.

Несколько дней назад я ввел крысе GFP-меченые Т-клетки, специфичные к альбумину. Сегодня я собираюсь провести стимуляцию этой же крысы в области уха. В правое ухо я введу альбумин.

В левое ухо я введу PBS. Доза волина, которую я ввожу, составляет 20 µg в 20 µL. В качестве альбумина я использую смесь в соотношении один к одному альбумина, меченного Texas Red, и немеченого альбумина.

Это тот самый туалет, на котором я продемонстрирую технику инъекции. Поскольку я правша, я использую левую руку. С левой руки я снял перчатку, чтобы иметь возможность поместить один палец под ушную раковину, а другой — над ней, чтобы растянуть кожу; так я смогу точно видеть положение иглы и вводить её между двумя слоями кожи в области уха, где она очень тонкая.

Для этого я использую иглы 27G, чтобы обеспечить максимально тонкое проникновение. Если я поверну ухо, вы отчетливо увидите, куда попал Texas Red, а куда — PBS. Сейчас прошло 42 часа после введения challenged-агента в ухо, и я собираюсь использовать пружинный микрометр для измерения толщины ушной раковины.

Таким образом, я измерю оба уха: правое, в которое вводили альбумин, и левое, которое не подвергалось воздействию. Разница в толщине ушных раковин позволит оценить интенсивность воспаления. Таким образом, я продемонстрировал вам всю процедуру проведения адаптивной РЗГ у крыс.

Таким образом, я продемонстрировал вам способ активации антигенспецифических T-клеток in vitro, метод их адаптивного переноса крысам, а также способ последующего воздействия на этих крыс и измерения степени воспаления. В лаборатории Чанда мы регулярно используем эту процедуру для проверки влияния блокаторов калиевых каналов на воспаление у крыс.