Инкапсуляция кардиомиоцитов в Фибрин Гидрогель для сердечной тканевой инженерии

Общая цель этой процедуры заключается в инкапсуляции кардиомиоцитов новорожденных крыс в гидрогель FI для инженерии сердечной ткани. Это достигается путем выделения сердец двух-трехдневных новорожденных крыс в возрасте от двух до трех дней. Далее сердца перевариваются в коллагеназе.

Чтобы отделить сердечные клетки от внеклеточного матрикса, сердечные клетки затем инкапсулируются в фибриновый гидрогель. Наконец, конструкции культивируют в течение двух недель. В конечном счете, результаты показывают, что конструкции обладают способностью генерировать силу подергивания примерно в 1,3 миллиньютона в ответ на электрическую стимуляцию.

Кроме того, выровненную структуру конструкции можно наблюдать с помощью гистологического окрашивания из белков миоцитов. Инженерные конструкции миокарда могут служить потенциальной терапией при инфаркте миокарда, позволяя восстанавливать или заменять рубцовую ткань инженерной тканью, тем самым улучшая сердечную функцию после травмы или заболевания. Эти конструкции могут служить ценной моделью in vitro для изучения влияния различных стимулов на сократительные силы и нормальное и патофизиологическое развитие сердца.

После подготовки среды и стерилизации хирургических инструментов для каждого человека, поместите впитывающую подкладку для скамьи на капюшон, рабочую поверхность и накройте ее стерильной простыней. Поместите стерильные хирургические инструменты и марлевую салфетку четыре на четыре на стерильную простыню. Не прикасаясь к инструментам, откройте стерильное лезвие скальпеля No 20 и положите его на драпировку.

Обезглавив щенка, промокните грудь марлей, смоченной Бетадином. Закрепите щенка, сжав лопатки вместе. Выполните частичную торакотомию, чтобы обнажить сердце, увеличить давление, оказываемое на лопатки, что заставит сердце пройти мимо ребер.

Для рассечения лопатки проведите лезвием скальпеля за сердцем, чтобы перерезать магистральные сосуды и удалить орган. Поместите сердце на лед в чашку Петри, содержащую глюкозу PBS. После того, как сердца будут изолированы, удалите остатки крови и соединительной ткани, промыв их ледяной глюкозой PBS.

Удалите верхнюю треть каждого сердца, чтобы остались нижние две трети. Изолировать только большую часть ткани желудочка и поместить ткань в свежую чашку Петри с ледяной глюкозой PBS. Используя стерильные микроножницы и щипцы, осторожно измельчите сердечки примерно на один кубический миллиметр.

Перенесите ткань в коническую трубку объемом 50 миллилитров и удалите все буферы, кроме 10 миллилитров. Добавьте семь миллилитров раствора коллагеназы. Встряхните тканевую смесь коллагеназы при температуре 37 градусов Цельсия в течение семи минут.

Аккуратно пипеткой 10 раз, чтобы разбить кусочки ткани. Дайте кусочкам осесть, а затем втяните жидкость и выбросьте ее. Добавьте семь миллилитров коллагеназы к кусочкам ткани и снова переваривайте в течение семи минут.

Для каждого оставшегося шага аккуратно пипетируйте 10 раз, чтобы разбить кусочки ткани. После того, как они осядут, оттяните надосадочную жидкость и соберите ее в отдельную коническую пробирку объемом 50 миллилитров, добавьте к кусочкам ткани семь миллилитров коллагеназы и снова переварите в течение семи минут. В каждую надосадочную жидкость добавляйте по 10 миллилитров стоп-раствора с помощью разной серологической пипетки после каждого добавления надосадочной жидкости из процесса разложения.

Для подготовки к литью фибриновых гелевых конструкций обратитесь к письменной части протокола. Поместите ранее изготовленные оправки в корпуса шприцев объемом шесть куб. см Используя шприц объемом три куб. см в качестве поршня, чтобы обеспечить плотное уплотнение между уплотнительными кольцами и тефлоновыми шайбами. Чтобы приготовить один миллилитр фибринового геля, создайте раствор F в конической пробирке, добавив 112 микролитров запаса фибриногена к 558 микролитрам 20 миллимолярных куч.

Буферизуйте в 0,9%-ном солевом растворе в отдельной конической пробирке. Создайте Т-раствор, добавив 17 микролитров тромбинового запаса и 1,3 микролитра двух обычных растворов кальция к 135 микролитрам DMEM. В третьей конической трубке сверните клетки вниз и ресуспендируйте их до концентрации 29,4 миллиона клеток на миллилитр, что в шесть раз превышает концентрацию желаемой конечной концентрации клеток в конструкции.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности на этапе изготовления конструкта. После смешивания растворов фибриногена и тромбина полимеризация фибрина происходит быстро. Таким образом, люди должны работать быстро, чтобы обеспечить однородное решение, предотвращая при этом попадание пузырьков воздуха в гидрогель при впрыске в литье формы.

Когда все будет готово к отливке фибринового геля, подготовьте одномиллилитровый шприц с помощью полуторадюймовой иглы 18-го калибра. Также подготовьте иглу 21 калибра в один дюйм. Чтобы приготовить один миллилитр раствора фибринового геля, добавьте 667 микролитров раствора F в 50-миллилитровую центрифужную пробирку, а затем 167 микролитров клеточного раствора.

И, наконец, 167 микролитров раствора Т. Тщательно пипеткой переливайте смесь, чтобы не ввести пузырьки воздуха. На этом этапе реакция началась, и внедрение конструкции должно быть выполнено немедленно.

С помощью шприца и иглы 18 калибра наберите раствор фибрина. Следите за тем, чтобы шприц не переворачивался, чтобы предотвратить попадание пузырьков в иглу. Замените стрелку 18 калибра на стрелку 21 калибра.

Осторожно постучите по шприцу, чтобы вытеснить пузырьки воздуха. Затем вставьте шприц в форму между пробкой, оболочкой которой следует за пазом в тефлоновом уплотнительном кольце, и введите раствор в форму. Наклоните форму, чтобы обеспечить полное заполнение.

Затем заполните оставшиеся формочки. Заверните формочки в парапленку группами по три штуки и поместите их в инкубатор или духовку при температуре 37 градусов Цельсия. Инкубируйте гели в течение 20 минут, чтобы дать фибрину достаточно времени для полной полимеризации.

Наполните каждую баночку с культурой 21 миллилитром конструктивной среды миокарда на конструкт. Используйте стерильный трехкубовый корпус шприца в качестве поршня, чтобы втиснуть оправку с конструкцией в большую чашку Петри с DMEM. Затем поместите конструкцию в банку с образцом.

Инкубируйте банки при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух недель. Чтобы начать разбор фибриновой конструкции зажима, аллигатор зажимает провод, идущий от стимулятора, к проводам на электродах в ванне. Включите плату сбора данных, генератор импульсов и преобразователь силы.

Установите преобразователь силы в положение 5G и обнулите его. Откройте пользовательскую программу лабораторного просмотра, которая отображает и сохраняет данные от преобразователя силы. Создайте новый пустой текстовый файл в папке данных для каждого образца с помощью пинцета, снимите конструкцию с опоры оправки, аккуратно сдвинув кольцо конструкции с тефлоновой опоры и поместив его на неподвижную металлическую стойку в системе измерения силы.

Средняя ванна. С помощью пинцета толкайте и поднимайте конструкцию вокруг стойки датчика силы. Поместите другой конец конструкции на кронштейн датчика и затягивайте до тех пор, пока датчик не начнет считывать показания.

Усилие 1,0 G на кардиостимулятор. Установите импульсное напряжение на 20 вольт, продолжительность на шесть миллисекунд и частоту на один герц. Запустите электрический темп, нажав кнопку выключения выхода.

Начинайте запись до тех пор, пока форма волны не станет обычной. Проанализируйте форму волны в MATLAB, чтобы определить силу скорости сокращения и скорость расслабления. Фибриновая конструкция кардиомиоцитов изначально покрывает всю ширину формы.

После двух недель культивирования он сжимается примерно до одной пятой от первоначальной ширины. Электрический темп конструкции генерирует данные о силе дергания, как показано здесь. Ожидается сила подергивания примерно в 1,3 миллиньютона.

Жизнеспособность клетки конструкта зависит от того, насколько далеко клетки находятся от поверхности конструкции, которая находится в контакте с питательной средой из-за ограничений диффузии кислорода в конструкцию. На поверхности конструкта с помощью конфокальной микроскопии наблюдается высокая жизнеспособность клеток. Выровненная структура конструкции наблюдается путем окрашивания на миозиновую тяжелую цепь в красный цвет Connexion 43, которая необходима для клеточного соединения между миоцитами, в зеленый цвет.

После освоения весь протокол должен занять около пяти часов. Часть изоляции I займет около трех часов. В то время как изготовление конструкта займет около двух часов, при попытке выполнить эту процедуру важно всегда держать иглу направленной вниз, чтобы предотвратить попадание пузырьков воздуха в фибриновую сеть.

Кроме того, наклон формы всегда будет удерживать отверстие иглы в самой высокой точке во время впрыска, что гарантирует, что отливка формы будет полностью заполнена раствором фибрина. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как инкапсулировать кардиомиоциты в фибриновые гидрогели в форме кольца, сначала изолировав кардиомиоциты от новорожденных крыс, а затем методом литья раствора фибрина под давлением в легко собираемые цилиндрические формы.