Видео-курс сканирующей конфокальной микроскопии и Microendoscopy

В этом видео показано, как построить сканирующий сканирующий конфокальный микроскоп с использованием стандартных компонентов. Сканирующий конфокальный микроскоп основан на скоординированном движении двух сканирующих зеркал для трансляции луча через растровую плоскость: свет от первого зеркала сканируется горизонтально через первый набор релейных линз, который фокусирует его обратно в неподвижную точку на втором сканирующем зеркале. То же самое сканирующее движение затем транслируется через скан и трубную линзу, помещая теперь расширенный световой луч на заднюю апертуру объектива.

Второе зеркало, движение которого происходит медленнее по сравнению с первым зеркалом, одновременно сканирует ось Y, что позволяет сканировать ее выше и ниже иллюстрированной плоскости и создавать прямоугольный растр на поверхности образца. Основным преимуществом этого протокола перед покупкой коммерчески доступного микроскопа является низкая стоимость и возможность настройки инструмента в соответствии с конкретными потребностями проекта визуализации. При работе с любым лазером жизненно важно принимать соответствующие меры безопасности, чтобы не допустить травмирования глаза.

Обязательно надевайте соответствующие лазерные защитные очки, когда это возможно. Зрители и/или исследователи, которые не ориентируются или не работают с лучом активно, должны всегда носить очки. Снимите все блестящие и отражающие часы или украшения.

Самое главное, обязательно следите за лучом и управляйте им в любое время, ограничивая его путь с помощью блока луча или вмонтированной визитной карточки. Это особенно важно при выравнивании зеркал, так как траекторию луча может быть трудно предсказать. Кроме того, никогда не ставьте глаза на один уровень с траекторией луча.

Выключите лазер, если вам нужно пересечь плоскость луча перед сборкой микроскопа. Убедитесь, что все необходимое для строительства оборудование доступно, включая оптическую макетную плату и кронштейны под углом 90 градусов, все зеркала, линзы и дихроику, а также соответствующие зажимы и крепежные приспособления, как сканирующие зеркала, так и фотодетектор. Также полезно иметь под рукой генератор функций для проверки сканирования и манипуляций с зеркалами во время юстировки.

Также настоятельно рекомендуется прикрутить макетную плату болтами для устойчивости. Начните сборку микроскопа с размещения оптоволоконного атора в оптическом креплении и размещения этого узла в середине оптической макетной платы. Это соответствует происхождению синего луча, как показано здесь.

Включите источник света. С помощью регулировочных винтов примерно отрегулируйте луч так, чтобы он двигался по прямой линии как по горизонтали, так и по вертикали. Поместите радужную оболочку перед оптоволоконным коллатором.

Далее отрегулируйте высоту диафрагмы так, чтобы луч проходил через центр. Затем переместите диафрагму от атора по траектории луча. Проверьте выравнивание луча.

При необходимости с помощью двух регулировочных винтов переместите луч на радужную оболочку. Поместите установленное зеркало diic на пути луча так, чтобы лазерный луч располагался в центре зеркала. Поверните держатель зеркала так, чтобы отразить луч примерно на 90 градусов, следя за тем, чтобы высота луча не менялась.

Прижмите зеркало к столу, закрутив винты на креплении. Затем поместите установленное резонансное гальваническое метрическое зеркало в траекторию лазерного луча. Следите за тем, чтобы лазерный луч располагался точно в горизонтальном центре зеркальной поверхности.

Поверните крепление зеркала, чтобы отразить лазерный луч под углом 90 градусов. Затем примерно отрегулируйте отражение от зеркала, чтобы сохранить ту же высоту лазерного луча по вертикали. Далее возьмите две радужки и поместите их прямо перед звучащей девушкой.

Затем, используя лазерный луч, отраженный от резонансного зеркала галактики в качестве эталона, установить их вертикальную высоту, как и раньше. Теперь, используя отверстия для винтов на оптической макетной плате в качестве направляющей для проушины, зажмите две радужные оболочки вниз по прямой линии. Отрегулируйте первое зеркало в траектории, которое является дихроичным, чтобы центрировать луч на первой радужной оболочке.

Затем отрегулируйте второе зеркало в контуре. Резонансная гал для центрирования луча на второй радужной оболочке. Итерационно регулируйте эти два зеркала до тех пор, пока луч не будет выровнен через обе радужные оболочки.

Обеспечение того, чтобы лазерный луч, отраженный от резонансного зеркала gal, все еще отражался от приблизительного центра зеркала. Если луч отклоняется, отрегулируйте крепление оптоволоконного коллатора и повторите регулировку, центрируя луч на обеих открытых радужных оболочках. Следующим шагом является размещение двух релейных линз, которые будут отображать первую неподвижную телецентрическую плоскость, на вторую неподвижную телецентрическую плоскость.

Для этого конкретного микроскопа выбранные объективы в первом реле имеют одинаковое фокусное расстояние F, поэтому расстояние между двумя зеркалами здесь составляет просто четыре F. Для этой конфигурации F равна 90 миллиметрам, поэтому положение четырех F будет находиться на расстоянии 360 миллиметров от сканирующего зеркала. Чтобы убедиться, что линзы точно отцентрированы на пути луча, поместите первую линзу на пути луча и посмотрите на пятно лазерного луча на следующей диафрагме на пути луча. Следуя за линзой, отрегулируйте высоту линзы так, чтобы вертикальный центр луча находился в центре диафрагмы.

Затем отрегулируйте положение горизонтального луча, чтобы центрировать луч на диафрагме. Повторите этот процесс со второй линзой. Затем будет установлено сканирующее зеркало и повернут микроскоп, чтобы облегчить простое размещение и выравнивание деталей, которые в противном случае пришлось бы регулировать по вертикали.

Чтобы определить точное положение второй телецентрической плоскости, подключите резонансную галактику O к ее сканирующему блоку и включите его. Используйте визитную карточку, чтобы проследить путь сканирующего луча через две линзы. Вторая телецентрическая плоскость будет расположена примерно в четырех градусах F от резидентной точки O и может быть идентифицирована как место, где сканирующий луч кажется неподвижным.

Отметьте карандашом макетную доску под этим местом. После того, как телецентрическая плоскость будет определена, установите вход сканирующего зеркала на ноль вольт и включите оборудование для управления зеркалом, чтобы зеркало опустилось в нейтральное положение. Затем расположите стандартное сканирующее галиловое зеркало в точном месте телеплоскости.

Отрегулируйте положение зеркала таким образом, чтобы луч в плоскости телеплоскости попадал точно в центр сканирующего зеркала, и затяните крепление зеркала. Теперь ослабьте стопорный винт, удерживающий зеркало gal, и поверните его, убедившись, что луч распространяется вертикально. Теперь выключите лазер и сканирующую электронику.

Отсоедините оптоволокно и отсоедините сканирующие зеркала. Затем с помощью монтажных кронштейнов на макетной плате под углом 90 градусов. Закрепите вторую макетную плату на первой.

Наконец, осторожно поверните весь микроскоп так, чтобы новая макетная плата лежала ровно, и используйте зажим, чтобы зафиксировать микроскоп на месте. Снова подключите gal o и лазер здесь и не забудьте вернуть gal O к нулю вольт. Остальная часть ранее вертикальной настройки может быть легко выполнена на плоской макетной плате.

Далее мы настроим второй набор релейных линз, формально называемых сканирующей линзой и тубусной линзой. Пожалуйста, ознакомьтесь с прилагаемым письменным протоколом для получения очень важной информации о выборе правильной комбинации линз. Начните с настройки объективов.

Во-первых, разложите зеркала, необходимые для направления луча к линзе объектива. Поместите первое большое двухдюймовое зеркало близко к краю макетной платы и поверните крепление зеркала, чтобы отразить лазерный луч примерно на 90 градусов. Отрегулируйте отражение от зеркала, чтобы сохранить ту же высоту вертикального луча.

Затем поместите другое двухдюймовое зеркало на противоположный край макетной платы, чтобы направить луч под углом 90 градусов, и с помощью регулировочных винтов закрепите его на месте. Затем установите две диафрагмы и отрегулируйте два зеркала, как и раньше, чтобы центрировать луч. Затем поместите объектив сканирования на его фокусное расстояние от гала на пути луча и отрегулируйте его горизонтальное и вертикальное положение.

Чтобы центрировать лазерное пятно на первой диафрагме между двумя зеркалами. Осторожно поместите большую двухдюймовую трубчатую линзу на соответствующем расстоянии от сканирующей линзы и отрегулируйте ее горизонтальное и вертикальное положение, чтобы центрировать луч на первой радужной оболочке. В этой конфигурации тубусная линза размещается на расстоянии 75 миллиметров плюс 300 миллиметров со всеми компонентами на месте.

Подключите gal O к выходу стандартного электрического функционального генератора или цепи управления и установите пиковое напряжение на уровне от одного до трех вольт. Затем начните сканирование двух зеркал с помощью визитной карточки. Расположите лазерный луч в неподвижной плоскости, на расстоянии 300 миллиметров от трубчатой линзы.

Поместите линзу объектива на пути луча, расположив заднюю диафрагму объектива как можно ближе к неподвижной плоскости. Настройте предметный столик для образца, следя за тем, чтобы перемещаемое крепление оси Z не касалось крепления объектива при его перемещении по всему диапазону. Настройка конфокала, точечной дыры и детектора начинается с отключения всех блоков питания и оптоволокна.

Поверните узел микроскопа так, чтобы он снова упирался в макетную плату, удерживая резонансное сканирующее зеркало. После повторного подключения волокна к коллиматору и штатному сканирующему зеркалу, кабелям питания, питания и управления, поместите ноль вольт на управляющее напряжение, приводящее в движение стандартную сканирующую галию, как и раньше на сцене, поместите образец яркого красителя между двумя покровными листами. Затем включите источник лазера и сфокусируйте краситель.

Отрегулируйте мощность лазера, чтобы сделать флуоресценцию как можно ярче, с помощью визитной карточки. Проследите флуоресцентное излучение от образца через линзу объектива через сканирующую систему до дихроичного зеркала, которое отражает лазерный луч и будет пропускать флуоресцентное излучение. Найдите этот флуоресцентный сигнал по другую сторону дихроичного зеркала.

Теперь приглушите свет в комнате. Поместите зеркало за дихроичным зеркалом, чтобы отражать излучение под углом 90 градусов. Затем с помощью диафрагмы с зеркалом направьте флуоресцентный луч как можно прямее и параллельно макетной плате.

Затем конфокальный обскурный блок будет настроен с помощью узла крепления пространственного фильтрующего каркаса от Thor Labs. На этой схеме показана настройка. Сканирующее зеркало находится на неподвижных плоскостях, которые телесвязаны с неподвижным объективом.

Пары линз в плоскости задней апертуры между неподвижными плоскостями действуют для передачи сканируемых лучей. Первая пара линз имеет равнофокусные линзы, образуя телескоп один к одному. Вторая пара линз, формально известная как сканирующая линза и трубная линза, не обязательно должна иметь одинаковое фокусное расстояние и часто служит телескопом, расширяющим луч, чтобы обеспечить переполнение задней апертуры объектива.

Свет, излучаемый образцом, проходит обратно через сканирующую систему и пропускается через дихроичное зеркало. Короткофокусный объектив или объектив фокусирует излучаемый свет через конфокальное отверстие, которое затем сопоставляется с линзой. Конечная линза фокусирует конфокальное отфильтрованное излучение на фотоумножительной трубке.

Расположите блок пространственного фильтра на одной линии с траекторией излучения, стараясь центрировать первое крепление фокусирующего объектива на луче излучения. В данном случае был выбран блок пространственной фильтрации с размером точечного отверстия 100 мкм. Затем установите объектив с коротким фокусным расстоянием в устройство и сдвиньте крепление для перемещения Z, пока на поверхности отверстия не будет наблюдаться четкая фокусировка.

Убедитесь, что весь блок ориентирован по прямой линии, заданной флуоресцентным лучом. Прижмите блок к макетной плате. Теперь с помощью ручек регулировки на столике трансляции настройте две оси, чтобы выполнить 2D-поиск по поверхности крепления точечного отверстия, чтобы найти точку, где флуоресцентный сигнал через отверстие максимален.

Затем поместите линзу с покрытием на крепление в клетке После отверстия с помощью визитной карточки найдите флуоресцентный ион, который проходит через конфокальный блок, и сдвиньте линзу с покрытием вдоль стоек до тех пор, пока излучаемая флуоресценция не станет максимально сопоставленной. Настройте узел фотоумножителя в сборе. Поместите линзу с фокусным расстоянием 50 мм на траекторию луча флуоресцентного излучения и найдите ее фокусную точку.

Отметьте это положение на макетной плате. Теперь полностью выключите лазер и расположите фотоумножитель так, чтобы его окошко располагалось как можно ближе к отмеченной фокусной точке. Затем с помощью регулируемых трубок объектива подсоедините узел к фокусирующей линзе.

Оберните темной лентой все открытые пути луча, следующие за отверстием, включите лазер, сохраняя его мощность на предельно низком уровне. Включите фотоумножитель, внимательно считывая его напряжение на осциллографе. По мере увеличения интенсивности лазера увеличивайте напряжение до тех пор, пока на экране осциллографа не будет виден пик, похожий на считывание и/или смещение постоянного тока.

Подтвердите, что этот сигнал действительно возникает из-за флуоресценции, выключив питание лазера или заблокировав траекторию луча, чтобы наблюдать потерю сигнала. Наконец, итеративно выровняйте отверстие для получения максимального сигнала на осциллографе. Сначала изменяя положение фокусирующего объектива по оси Z, а затем регулируя ступень трансляции YZ, аппаратное обеспечение микроскопа со скоростью видео готово.

Для начала выключите фотоумножитель. Теперь подключите зеркала, пользовательские платы управления и компьютер, как указано на схеме в прилагаемом письменном протоколе. Данная система может быть адаптирована для выполнения конфокальной сканирующей микроэндоскопии.

При замене столика на столик для удержания волокна см. сопроводительный текст или подробности. Готовый вертикальный конфокальный сканирующий микроскоп и микроэндоскоп должны выглядеть, как показано на рисунке. Лазерный и эмиссионный лучи были нарисованы в качестве ориентира для глаза.

Во время микроэндоскопии волоконное крепление удерживает волокно изображения на месте для проведения экспериментов. Это оптоволоконное крепление можно легко заменить на двухкоординатный столик для использования. Показанная здесь вертикальная платформа микроскопа представляет собой репрезентативное тестовое изображение, сделанное со строчной буквы «М», напечатанной на белой визитной карточке с использованием карты видеоскоростного фреймграббера для генерации изображений на основе входящего сигнала. Беленый.

Белая бумага содержит флуоресцентную силу, которая легко возбуждается ультрафиолетовым и синим светом, что приводит к появлению яркого фона за темным светом. Для сбора этого флуоресцентного излучения была выбрана буква М и эмиссионный фильтр с центром в 515 нанометров. Незначительное искажение изображения может наблюдаться, особенно вблизи боковых краев кадра изображения.

Это искажение является результатом синусоидального сканирования восьмикилогерцового зеркала gvo и подробно обсуждается в сопроводительном документе. В этом фильме показаны примеры данных о скорости видео, полученных при сканировании визитной карточки. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как построить и выровнять скоростной видеоскоп с конфокальным сканированием.

Не забывайте, что работа с лазерным светом может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как снятие всех отражающих украшений, а также избегание работы с глазами на уровне линии луча.