Видео-курс сканирующей конфокальной микроскопии и Microendoscopy

В данном видео демонстрируется способ конструирования сканирующего конфокального микроскопа с видеочастотой сканирования с использованием стандартных серийных компонентов. Работа сканирующего конфокального микроскопа основана на скоординированном движении двух сканирующих зеркал для перемещения луча по растровой плоскости; свет от первого зеркала сканируется горизонтально через первый набор релейных линз, которые фокусируют его обратно в неподвижную точку на втором сканирующем зеркале. Затем то же сканирующее движение передается через сканирующую линзу и тубусную линзу, в результате чего расширенный световой пучок попадает на заднюю апертуру объектива.

Второе зеркало, движение которого медленнее по сравнению с первым, одновременно сканирует ось Y, что позволяет осуществлять сканирование выше и ниже иллюстрируемой плоскости, создавая прямоугольный растр на поверхности образца. Основным преимуществом данного протокола перед покупкой коммерчески доступного микроскопа является низкая стоимость и возможность адаптировать прибор под конкретные нужды проекта по визуализации. При работе с любым лазером крайне важно соблюдать надлежащие меры безопасности для предотвращения повреждения органов зрения.

По возможности всегда используйте соответствующие защитные очки для работы с лазером. Зрители и исследователи, которые не занимаются активной юстировкой или работой с лучом, также должны постоянно носить очки. Снимите все блестящие и отражающие часы или украшения.

Что самое важное, обязательно следите за лучом и контролируйте его в любое время, перекрывая его путь с помощью светового стопора или закрепленной визитной карточки. Это особенно важно при юстировке зеркал, так как траектория луча может быть труднопредсказуемой. Кроме того, никогда не держите глаза на одном уровне с путем прохождения луча.

Выключите лазер, если вам потребуется пересечь плоскость луча перед сборкой микроскопа. Убедитесь в наличии всего оборудования, необходимого для сборки, включая оптическую плиту и кронштейны под углом 90 градусов, все зеркала, линзы и дихроичный фильтр, а также соответствующие зажимы и крепежные детали, сканирующие зеркала и фотодетектор. Также будет полезно иметь под рукой генератор функций для проверки процесса сканирования и управления зеркалами во время юстировки.

Для обеспечения устойчивости также настоятельно рекомендуется закрепить оптический стол болтами. Начните сборку микроскопа, установив волоконный адаптер с разъемом pigtail в оптический держатель, а затем поместив этот узел в центр оптического стола. Это соответствует источнику синего луча, как показано здесь.

Включите источник света. С помощью регулировочных винтов грубо настройте луч так, чтобы он проходил по прямой линии как по горизонтали, так и по вертикали. Поместите ирисовую диафрагму перед коллиматором волокна.

Затем отрегулируйте высоту ирисовой диафрагмы так, чтобы пучок проходил через ее центр. После этого переместите диафрагму от аторического зеркала вдоль пути пучка. Проверьте юстировку пучка.

При необходимости используйте два регулировочных винта, чтобы переместить луч на диафрагме. Поместите установленное диихроичное зеркало на пути луча так, чтобы лазерный луч был направлен в центр зеркала. Поверните держатель зеркала, чтобы отразить луч примерно под углом 90 градусов, следя за тем, чтобы высота луча не изменилась.

Закрепите зеркало на столе, затянув винты на держателе. Затем поместите установленное резонансное гальванометрическое зеркало на путь лазерного луча. Убедитесь, что лазерный луч направлен точно в горизонтальный центр поверхности зеркала.

Поверните крепление зеркала так, чтобы лазерный луч отражался под углом 90 градусов. Затем грубо отрегулируйте отражение от зеркала, чтобы сохранить ту же вертикальную высоту лазерного луча. После этого возьмите две ирисовые диафрагмы и установите их непосредственно перед резонансным гальваномером.

Затем, используя лазерный луч, отраженный от резонансного гальванометрического зеркала, в качестве ориентира, установите их высоту по вертикали, как и ранее. Теперь, ориентируясь по резьбовым отверстиям на оптическом столе, закрепите две диафрагмы в одну линию. Отрегулируйте первое зеркало на пути луча — дихроичное зеркало, — чтобы центрировать луч относительно первой диафрагмы.

Затем отрегулируйте второе зеркало в тракте. Используйте резонансный гальванометр, чтобы центрировать луч на второй диафрагме. Повторяйте настройку этих двух зеркал до тех пор, пока луч не будет выровнен по обеим диафрагмам.

Убедитесь, что лазерный луч, отраженный от резонансного гальванометрического зеркала, по-прежнему отражается от приблизительного центра зеркала. Если луч отклонен, отрегулируйте крепление коллиматора волокна и повторите настройку так, чтобы луч был центрирован относительно обеих открытых диафрагм. Следующим шагом является установка двух релейных линз, которые будут переносить изображение первой стационарной телецентрической плоскости на вторую стационарную телецентрическую плоскость.

Для данного конкретного микроскопа выбранные линзы в первом реле имеют одинаковое фокусное расстояние F, поэтому расстояние между двумя зеркалами здесь составляет просто четыре F. В данной установке F равно 90 миллиметрам, следовательно, положение 4F будет находиться на расстоянии 360 миллиметров от сканирующего зеркала. Чтобы убедиться, что линзы точно центрированы на пути луча, поместите первую линзу на путь луча и посмотрите на пятно лазерного луча на следующей ирисовой диафрагме в тракте луча. После установки линзы отрегулируйте ее высоту так, чтобы вертикальный центр луча совпадал с центром диафрагмы.

Затем отрегулируйте положение горизонтального луча, чтобы центрировать его относительно ирисовой диафрагмы. Повторите эту процедуру для второй линзы. Далее следует установить сканирующее зеркало и повернуть микроскоп, чтобы упростить установку и юстировку деталей, которые в противном случае потребовали бы вертикальной регулировки.

Чтобы определить точное положение второй телецентрической плоскости, вставьте резонансный гальванометр в сканирующий блок и включите его. Используйте визитную карточку, чтобы проследить путь сканирующего луча через две линзы. Вторая телецентрическая плоскость будет находиться примерно на расстоянии 4F от резонансного гальванометра; она определяется как точка, в которой сканирующий луч кажется неподвижным.

Отметьте карандашом на монтажной плате место под данной точкой. После определения телецентрической плоскости установите вход сканирующего зеркала на 0 В и включите оборудование управления зеркалом, чтобы зеркало перешло в нейтральное положение. Затем установите стандартное сканирующее гальванометрическое зеркало точно в месте нахождения теле-плоскости.

Отрегулируйте положение зеркала так, чтобы луч в дальней фокальной плоскости попадал точно в центр сканирующего зеркала, и затяните крепление зеркала. Затем ослабьте стопорный винт, удерживающий гальванометрическое зеркало, и поверните его, убедившись, что луч распространяется вертикально. После этого выключите лазер и электронику сканирования.

Отсоедините оптоволокно и отсоедините сканирующие зеркала. Затем, используя монтажные L-образные кронштейны для оптического стола, закрепите второй оптический стол на первом.

Наконец, осторожно поверните весь микроскоп так, чтобы новая оптическая плита лежала горизонтально, и с помощью зажима зафиксируйте микроскоп в этом положении. Снова подключите гальванометр и лазер, не забыв вернуть напряжение на гальванометре к 0 V. Остальные этапы настройки, которая ранее выполнялась в вертикальном положении, можно легко реализовать на плоской оптической плите.

Далее мы установим вторую группу ретранслирующих линз, официально называемых сканирующей линзой и тубусом объектива. Пожалуйста, ознакомьтесь с прилагаемым письменным протоколом, чтобы получить очень важную информацию о выборе подходящей комбинации линз. Начните с установки линз.

Сначала расположите зеркала, необходимые для направления луча к объективу. Поместите первое большое двухдюймовое зеркало близко к краю оптического стола и поверните держатель зеркала так, чтобы отразить лазерный луч примерно на 90 градусов. Отрегулируйте отражение от зеркала, чтобы сохранить прежнюю вертикальную высоту луча.

Затем установите второе двухдюймовое зеркало на противоположном краю оптического стола, чтобы направить луч под углом 90 градусов, и зафиксируйте его с помощью регулировочных винтов. Далее установите две диафрагмы и, как и ранее, отрегулируйте два зеркала, чтобы центрировать луч. Затем поместите сканирующую линзу на пути луча на расстоянии ее фокусного расстояния от гальванометров и отрегулируйте ее положение по горизонтали и вертикали.

Для центрирования лазерного пятна на первой диафрагме между двумя зеркалами осторожно установите большую двухдюймовую тубусную линзу на соответствующем расстоянии от сканирующей линзы и отрегулируйте её горизонтальное и вертикальное положение так, чтобы луч был центрирован по первой диафрагме. В данной установке, при размещении всех компонентов, тубусная линза располагается на расстоянии 75 millimeters плюс 300 millimeters.

Подключите гальванометр O к выходу стандартного электрического генератора функций или схемы управления и установите размах напряжения от одного до трех вольт. Затем начните сканирование двух зеркал с помощью визитной карточки. Найдите лазерный луч в неподвижной плоскости, на расстоянии 300 миллиметров после тубусной линзы.

Поместите объектив на пути луча, стараясь расположить заднюю апертуру объектива как можно ближе к неподвижной плоскости. Установите предметный столик, убедившись, что при перемещении по всему диапазону крепление перемещаемой оси Z не задевает крепление объектива. Чтобы настроить конфокальную систему, диафрагму и детектор, начните с отключения всех источников питания и оптоволокна.

Поверните узел микроскопа так, чтобы он снова опирался на оптический стол, удерживая резонансный сканирующий зеркала. После повторного подключения волокна к коллиматору и стандартному сканирующему зеркалу, а также кабелей питания, подачи и управления, подайте нулевое напряжение на управляющий сигнал стандартного гальванометра сканирования, как и ранее на предметном столике, и поместите образец с ярким красителем, зажатый между двумя покровными стеклами. Затем включите источник лазерного излучения и сфокусируйтесь на красителе.

Отрегулируйте мощность лазера с помощью визитной карточки так, чтобы флуоресценция была максимально яркой. Проследите путь флуоресцентного излучения от образца через объектив и сканирующую систему к дихроичному зеркалу, которое отражает лазерный луч и пропускает флуоресцентное излучение. Найдите этот флуоресцентный сигнал с другой стороны дихроичного зеркала.

Теперь приглушите свет в помещении. Поместите зеркало за дихроичным зеркалом, чтобы отразить эмиссию под углом 90 градусов. Затем, используя диафрагму с зеркалом, направьте луч флуоресценции максимально прямо и параллельно оптическому столу.

Затем будет настроен блок конфокального диафрагмирующего отверстия с использованием системы крепления пространственного фильтра в клетке от Thor Labs. На данной схеме представлена конфигурация установки. Сканирующее зеркало расположено в неподвижной плоскости, находящейся в телецентрическом положении относительно неподвижного объектива.

Пары линз в плоскости задней апертуры между неподвижными плоскостями служат для ретрансляции сканирующих пучков. Первая пара линз имеет равные фокусные расстояния, образуя телескоп с увеличением один к одному. Вторая пара линз, официально называемая сканирующей линзой и тубусной линзой, не обязательно должна иметь равные фокусные расстояния и часто выполняет функцию расширяющего телескопа для обеспечения переполнения задней апертуры объектива.

Свет, излучаемый образцом, проходит обратно через систему сканирования и проходит через дихроичное зеркало. Короткофокусная линза или объектив фокусирует эмиссионный свет через конфокальное отверстие, который затем коллимируется линзой. Финальная линза фокусирует отфильтрованное конфокальное излучение на фотоумножитель.

Установите блок пространственного фильтра вдоль пути пучка эмиссии, стараясь центрировать крепление первой фокусирующей линзы по пучку эмиссии. В данном случае был выбран блок пространственного фильтра с отверстием диафрагмы 100 microns. Затем установите в блок линзу с коротким фокусным расстоянием и перемещайте Z-транслятор до тех пор, пока на поверхности диафрагмы не будет виден четкий фокус.

Убедитесь, что весь узел ориентирован вдоль прямой линии, задаваемой флуоресцентным лучом. Закрепите узел на оптическом столе. Теперь, используя регулировочные ручки стяжки (трансляционного столика), настройте две оси для проведения двумерного поиска по поверхности крепления диафрагмы, чтобы найти точку, в которой сигнал флуоресценции через диафрагму будет максимальным.

Затем установите фильтрующий объектив на держатель-केज после диафрагмы (pinhole); с помощью визитной карточки найдите флуоресцентный луч, проходящий через конфокальный блок, и перемещайте фильтрующий объектив вдоль стоек до тех пор, пока излучаемая флуоресценция не станет максимально сфокусированной. Установите узел с фотоэлектронным умножителем. Поместите линзу с фокусным расстоянием 50 мм на путь пучка флуоресцентного излучения и найдите её фокус.

Отметьте это положение на макетной плате. Теперь полностью выключите лазер и установите фотоэлектронный умножитель так, чтобы его окно находилось как можно ближе к отмеченной фокальной точке. Затем с помощью регулируемых линзовых трубок соедините узел с фокусирующей линзой.

Оберните темной изолентой все открытые пути луча после стеноперифоратора, включите лазер, поддерживая его мощность на крайне низком уровне. Включите фотоэлектронный умножитель, внимательно отслеживая его напряжение на осциллографе. По мере увеличения интенсивности лазера повышайте напряжение до тех пор, пока на экране осциллографа не появится сигнал в виде всплеска и/или постоянное смещение.

Убедитесь, что данный сигнал действительно вызван флуоресценцией, выключив лазер или перекрыв путь луча, чтобы зафиксировать исчезновение сигнала. Наконец, итеративно настройте диафрагму (пинхол) для получения максимального сигнала на осциллографе. После первоначального изменения положения фокусирующей линзы по оси Z и последующей регулировки переводного столика по осям YZ сборка оборудования микроскопа для видеосъемки завершена.

Сначала выключите фотоэлектронный умножитель. Затем подключите специализированные платы управления зеркалами и компьютер согласно схеме, приведенной в прилагаемом письменном протоколе. Данную систему можно адаптировать для проведения конфокальной сканирующей микроэндоскопии.

Для замены предметного столика на держатель оптического волокна, пожалуйста, обратитесь к сопроводительному тексту или подробностям. Готовый вертикальный конфокальный сканирующий микроскоп и микроэндоскоп должны выглядеть так, как показано здесь. Пути лазерного и эмиссионного лучей нанесены для наглядности.

Во время операции микроэндоскопии волоконный держатель фиксирует изображениеволокно для проведения экспериментов. Для определенных целей этот держатель может быть легко заменен на XY-столик. На представленном здесь изображении платформы вертикального микроскопа показан репрезентативный снимок строчной буквы M, напечатанной на белой визитной карточке, полученный с помощью платы захвата кадров с видеочастотой для генерации изображений из входящего сигнала.Осветлено.

Белая бумага содержит флуорофоры, которые легко возбуждаются УФ- и синим светом, что приводит к появлению яркого фона за темными объектами. Для сбора этого флуоресцентного излучения был выбран эмиссионный фильтр с центральной длиной волны 515 нм. Можно заметить незначительное искажение изображения, особенно у боковых краев кадра.

Это искажение возникает из-за синусоидального паттерна сканирования гальванозеркала с частотой 8 кГц и подробно обсуждается в сопроводительном документе. В данном видео представлены примеры данных, полученных при сканировании визитной карточки с видеочастотой. После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как собрать и юстировать конфокальный сканирующий микроскоп, работающий с видеочастотой.

Помните, что работа с лазерным излучением может быть крайне опасной, поэтому при выполнении данной процедуры следует всегда соблюдать меры предосторожности, такие как снятие всех reflective ювелирных украшений и недопущение нахождения глаз на одном уровне с линией луча.