Однодневный рабочий процесс Схема бактериальных патогенов обнаружения и антимикробной сопротивления из крови культур

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы выявить и оценить чувствительность изолятов культуры крови к антибиотикам за меньшее время, чем при использовании традиционных методов. Это достигается путем предварительной идентификации изолята культуры крови. С использованием нового 16 s рибосомального анализа ДНК MultiPro PCR.

Затем изолят инкубируют с панелью антибиотиков в течение шести часов. Следующим шагом является определение роста или роста ингибирования изолята в присутствии антибиотика с использованием количественного 16 s рибосомального анализа D-N-A-P-C-R. В конечном счете, результаты показывают, что идентификация и тестирование чувствительности к антибиотикам изолята культуры крови могут быть получены быстрее с помощью этой комбинации культуры и ПЦР.

Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как использование автоматизированных систем phoenix или IIC, заключается в том, что не требуется предварительного статуса культивирования, а результаты идентификации и тестирования чувствительности к антибиотикам могут быть доступны в течение одного и того же дня. Демонстрацию процедуры будут проводить Ванди Хансон и аспиранты GID из нашей лаборатории, которые разбавят 100 микролитров культуры крови, положительной на рост микроорганизмов, в реакционной пробирке, содержащей 900 микролитров 0,9% хлорида натрия. Затем центрифугируйте образец при 13, 400 перегрузках в течение пяти минут, чтобы гранулировать бактерии после центрифугирования.

Риз, суспензируйте гранулу в 100 микролитрах стерильной деминерализованной воды. Установите образец при температуре четыре градуса Цельсия до дальнейшего использования. Когда все образцы будут готовы, приготовьте смеси для реакции ПЦР в реальном времени для амплификации специфической 16s рибосомальной ДНК из интересующих бактерий.

Используйте деминерализованную воду для регулировки объемов до 20 микролитров на реакцию. Аликвоту 20 мкл смеси ПЦР на лунку в 96 луночном ПЦР-планшете. Затем добавьте по пять микролитров образца в каждую лунку и запечатайте ПЦР-планшет.

Затем запустите ПЦР на системе ПЦР в реальном времени A BI Prism 7, 900 HT, чтобы проанализировать результаты после завершения ПЦР, сначала используйте вкладку настроек анализа, чтобы настроить анализ КТ на 0,1. Затем сузьте базовые конфигурации, чтобы начать шестой цикл и закончить цикл 15. Запишите значение CT для каждого образца.

Пороговое значение для признания положительного результата ПЦР обычно может быть установлено на значение CT, равное 35. В этом примере профиль идентификации культуры крови, инфицированной кишечной палочкой, показан в двух реакционных смесях. Были включены универсальные 16 s рибосомные праймеры ДНК, которые генерировали две амплификационные кривые CT 25.2 и 25.95.

Третья кривая амплификации получена из зонда, специфичного для Coli. Другие специфические зонды не генерировали обнаруживаемых сигналов. После того, как патоген был идентифицирован, можно провести тестирование на антибиотики.

Начните с переноса пяти миллилитров бульона из положительного посева крови в пробирку-сепаратор сыворотки. Центрифугируйте образец при температуре 2000 G в течение 10 минут после центрифугирования, выбросьте супан из пробирки. Затем с помощью стерильного ватного тампона перенесите бактерии из гелевого слоя пробирки в 0,9% хлорида натрия до тех пор, пока не будет получен раствор с мутностью 0,5 стандарта Макфарланда.

Это соответствует примерно 1,5 умножить на 10 к восьми колониеобразующим единицам на миллилитр. Далее разведите суспензию в двойной концентрации Мюллера Хинтона. Два бульона получить концентрацию примерно пять умно-10 на пять колониеобразующих единиц на миллилитр.

Аликвота 50 микролитров на лунку суспензии в микротитровальной тарелке, уже содержащей 50 микролитров на лунку набора антибиотиков. Обязательно включите положительный контроль роста для каждого образца с помощью колодцев с водой вместо антибиотиков. Накройте тарелку, когда закончите.

Затем инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия в течение шести часов, чтобы дать возможность размножиться бактериям. Обязательно храните аликвоту бактериальной суспензии при температуре четыре градуса Цельсия в качестве отрицательного контроля роста. После шестичасовой инкубации переложите содержимое каждой лунки и отрицательный контрольный образец в отдельные стерильные пробирки.

После пятиминутного центрифугирования при 16 000 раз. G, удалите 80 микролитров надосадочной жидкости и повторно суспендируйте гранулы в 80 микролитрах стерильной деминерализованной воды. Разбавьте образцы в соотношении от одного до 10 в воде перед использованием для 16 с рибосомальной ПЦР ДНК в реальном времени.

Приготовьте смесь для ПЦР с использованием суперсмеси IQ cyber green и 16 с рибосомальных ДНК-праймеров и аликвоты. 20 мкл на лунку в 96 луночном ПЦР-планшете. Затем добавьте по пять микролитров каждого образца в лунки и запечатайте пластину.

Далее запустите ПЦР для анализа результатов. Сначала рассчитаем пороговое значение CT. В общем случае, пороговый CT равен CT положительного контроля роста плюс 0,5-кратный CT отрицательного контроля роста за вычетом CT контрольной точки роста.

Однако для пиперациллина пиперациллина с тазобактамом и CEF дазади в грамотрицательных палочках, а также для амоксициллина, оксациллина и триметоприма с сульфаметоксазолом в золотистом стафилококке или из амоксициллина. При энтерококке СПП коэффициент размножения 0,5 следует снизить до 0,25. Восприимчивость или резистентность штаммов в каждом образце может быть определена путем сравнения КТ образца с КТ порогового значения.

Значение CT выше порогового значения указывает на восприимчивость, в то время как значение CT ниже порогового значения указывает на сопротивление. Вот пример графика усиления чувствительности к антибиотикам. Выявленный ранее штамм кишечной палочки был протестирован на чувствительность к нескольким антибиотикам, каждый из которых представлен отдельной кривой.

Образцами с низким значением КТ считаются образцы, в которых рост произошел в присутствии антибиотика, указывающего на устойчивость к тестируемому антибиотику. Напротив, высокое значение CT представляет собой образец, в котором не произошло никакого роста, что указывает на чувствительность к тестируемому антибиотику после освоения. Эту технику можно выполнить за девять часов, если она выполнена правильно.