Однодневный рабочий процесс Схема бактериальных патогенов обнаружения и антимикробной сопротивления из крови культур

Общая цель данной процедуры — идентификация и оценка чувствительности к антибиотикам изолятов из посева крови за меньшее время, чем при использовании традиционных методов. Это достигается путем первоначальной идентификации изолята из посева крови с помощью нового метода мультиплексной ПЦР MultiPro для анализа 16S рРНК.

Затем изолят инкубируют с панелью антибиотиков в течение шести часов. Следующим этапом является определение роста или ингибирования роста изолята в присутствии антибиотика с помощью количественного ПЦР-анализа 16 s рибосомной ДНК. В конечном счете результаты показывают, что идентификация и определение чувствительности к антибиотикам изолята из посева крови могут быть получены быстрее благодаря сочетанию культивирования и ПЦР.

Основным преимуществом данного метода перед существующими, такими как использование автоматизированных систем Phoenix или IIC, является отсутствие необходимости в предварительном культивировании, что позволяет получить результаты идентификации и определения чувствительности к антибиотикам в тот же день. Процедуру продемонстрируют Ванди Хансон и GID ing, аспиранты нашей лаборатории. Разведите 100 µL культуры крови с положительным микробным ростом в реакционной пробирке, содержащей 900 µL 0,9% раствора хлорида натрия. Затем центрифугируйте образец при 13 400 ×g в течение пяти минут для осаждения бактерий.

Риз, суспендируйте осадок в 100 µL стерильной деминерализованной воды. Храните образец при температуре 4 °C до дальнейшего использования. Когда все образцы будут готовы, приготовьте реакционные смеси для ПЦР в реальном времени для амплификации специфической 16 s рибосомальной ДНК интересующих бактерий.

Используйте деминерализованную воду для доведения объема до 20 µL на одну реакцию. Внесите по 20 µL ПЦР-смеси в каждую лунку ПЦР-планшета на 96 лунок. Затем добавьте по 5 µL образца в каждую лунку и загерметизируйте ПЦР-планшет.

Затем проведите ПЦР на системе ПЦР в реальном времени A BI Prism 7, 900 HT. После завершения ПЦР для анализа результатов сначала перейдите на вкладку настроек анализа, чтобы установить значение анализа CT на 0,1. Затем настройте параметры базовой линии, установив начальный цикл 6 и конечный цикл 15. Зафиксируйте значение CT для каждого образца.

Пороговое значение, при котором результат ПЦР считается положительным, обычно устанавливают на уровне CT 35. В данном примере представлен профиль идентификации посева крови, инфицированного E. coli, в двух реакционных смесях. Были использованы универсальные праймеры к 16s рибосомной ДНК, которые дали две кривые амплификации со значениями CT 25,2 и 25,95.

Третья кривая амплификации получена с использованием зонда, специфичного для Coli. Другие специфические зонды не дали обнаруживаемых сигналов. После идентификации патогена можно приступить к тестированию антибиотиками.

Начните с переноса пяти миллилитров бульона из положительной культуры крови в пробирку с разделителем сыворотки. Центрифугируйте образец при 2000 ×g в течение 10 минут; после центрифугирования удалите из пробирки супернатант. Затем с помощью стерильного ватного тампона перенесите бактерии из гелевого слоя пробирки в 0,9% раствор sodium chloride до получения раствора с мутностью, соответствующей стандарту 0,5 по МакФарланду.

Это соответствует примерно 1,5 × 10⁸ колониеобразующих единиц на миллилитр. Затем разведите суспензию в бульоне Мюллера-Хинтона двойной концентрации до получения концентрации примерно 5 × 10⁵ колониеобразующих единиц на миллилитр.

Внесите в лунки микротитрационного планшета, в которых уже находится по 50 µL выбранных антибиотиков, по 50 µL суспензии в каждую лунку. Обязательно включите положительный контроль роста для каждого образца, используя лунки с водой вместо антибиотиков. По завершении накройте планшет крышкой.

Затем инкубируйте планшет при 37 °C в течение шести часов для обеспечения роста бактерий. Обязательно сохраните аликвоту бактериальной суспензии при 4 °C в качестве отрицательного контроля роста. После шестичасовой инкубации перенесите содержимое каждой лунки и образец отрицательного контроля в отдельные стерильные пробирки.

После центрифугирования в течение пяти минут при 16 000 ×g удалите 80 мкл супернатанта и ресуспендируйте осадок в 80 мкл стерильной деминерализованной воды. Перед использованием для ПЦР в реальном времени 16S рРНК разведите образцы водой в соотношении 1:10.

Приготовьте ПЦР-смесь, используя IQ cyber green super mix и праймеры к 16 s рибосомальной ДНК, и внесите аликвоты по 20 µL в каждую лунку 96-луночного ПЦР-планшета. Затем добавьте по 5 µL каждого образца в лунки и герметично закройте планшет.

Затем проведите ПЦР для анализа результатов. Сначала рассчитайте пороговое значение CT. Как правило, пороговое значение CT равно CT положительного контроля роста плюс 0,5 умножить на CT отрицательного контроля роста минус CT контроля роста.

Однако для пиперациллина с тазобактамом и цефазолина при воздействии на грамотрицательные палочки, а также для амоксициллина, оксациллина и триметоприма с сульфаметоксазолом при воздействии на Staphylococcus aureus или для амоксициллина при воздействии на Enterococcus spp. коэффициент размножения 0,5 следует снизить до 0,25. Чувствительность или резистентность штаммов в каждом образце можно определить путем сравнения CT образца с пороговым значением ct.

Значение CT выше порогового указывает на чувствительность, в то время как значение CT ниже порогового указывает на резистентность. Перед вами пример графика амплификации при определении чувствительности к антибиотикам. Ранее идентифицированный штамм e coli был протестирован на чувствительность к нескольким антибиотикам, каждый из которых представлен отдельной кривой.

Образцы с низким значением CT — это образцы, в которых рост произошел в присутствии антибиотика, что указывает на резистентность к тестируемому антибиотику. Напротив, высокое значение CT соответствует образцу, в котором рост не наблюдался, что свидетельствует о чувствительности к тестируемому антибиотику. После освоения данной методики её выполнение при правильном подходе занимает девять часов.