Использование EpiAirway модель Характеризуя Долгосрочные хост-возбудителя Взаимодействия

Общей целью данного эксперимента является проведение долгосрочного совместного культивирования нетипизируемого гемофильного гриппа или НТИ с первичными респираторными эпителиальными тканями человека с использованием модели эпидулярных дыхательных путей. Это достигается путем инокуляции апикальной поверхности NTHI, чтобы позволить бактериям прилипнуть к тканям и проникнуть в них в качестве второго этапа. Вкладыши промываются каждые 24 часа с предварительно подогретым DPBS, чтобы имитировать нормальный поток слизи и удалить продукты жизнедеятельности муцина и любой клеточный мусор.

Затем ткани собирают в желаемый момент времени, и определяют выживаемость либо тотально-ассоциированного, либо интернализованного NTHI. Наконец, с помощью этого метода можно оценить специфические характеристики штамма выживаемости NTHI в тканях с течением времени на основе количества жизнеспособных бактерий. Тем не менее, этот метод может дать представление о долгосрочных инфекциях нетипизируемого гемофильного гриппа.

Он также может быть использован в изучении других человеческих патогенов, таких как Moraxella alis, демонстрируя эту процедуру, доктор Дойн провел постдокторант в моей лаборатории. Извлеките транспортировочную пластину из упаковки и приготовьтесь к началу эксперимента. Опрыскайте транспортировочную пластину 70% этанолом и поместите пластину в шкаф биобезопасности.

Аликвота одного миллилитра четырех градусов Цельсия, эпидыхательных путей, поддерживающих сред в каждую лунку шестилуночной пластины. Затем, сняв ленту, откройте пластину и снимите марлю, закрывающую вставки для дыхательных путей. С помощью вращательных движений с помощью пинцета освободите вставку от арос.

При необходимости поместите вставку в одну из лунок шестилуночной пластины. С помощью стерильной ватной палочки осторожно извлеките арос из вставки, избегая прикосновения к мембране. Убедитесь, что под вставками не задерживаются пузырьки воздуха.

А затем поместите шестилуночную пластину в инкубатор. Ежедневно мойте вкладыши следующим образом, предварительно подогрейте DPBS с кальцием и магнием, а наконечник заполните DPBS. Затем с помощью стерильных щипцов подберите вкладыш аккуратно пипеткой, нанесите 200 микролитров предварительно подогретого DPBS на ткань.

Затем покачайте вкладыш, чтобы равномерно распределить DPBS, не касаясь ткани. Затем наклоните вставку под углом и приложите наконечник пипетки P 1000 к пластиковому кольцу, которое удерживает мембрану в нижней части вставки. Затем осторожно отсасывайте буферный раствор и поместите раствор в криопробирку для последующего исследования.

Наконец, аспирируйте базальную поддерживающую среду и замените ее одним миллилитром свежей среды. Подогрейте больше DPBS с кальцием и магнием. Добавьте три миллилитра предварительно подогретого DPBS в 15-миллилитровую пробирку, а затем ресуспендируйте в пробирку единичные колонии нетипируемого гриппа или NTHI, выращенные за ночь на шоколадном агаре.

Теперь энергично вращайте трубку в течение не менее 10 секунд, а затем измерьте оптическую плотность. Продолжайте добавлять отдельные колонии NTHI до тех пор, пока концентрация бактерий не достигнет наружного диаметра 600 нанометров примерно 0,7. Затем промойте каждую вставку для дыхательных путей EPI с предварительно подогретым DPBS, как и раньше, а затем добавьте 28 микролитров бактериальной суспензии на апикальную поверхность каждой вставки.

Избегание инокуляции базальной поддерживающей среды. Затем верните тарелку в инкубатор для количественного определения NTHI, сначала предварительно разогрейте, а затем высушите поверхность шоколадными агаровыми пластинами. Затем последовательно разбавляют инокулюм NTHI с использованием стерильного PBS с 0,1% желатина или PBSG.

Капните на пластины 10 микролитров аликвот инокулята, а затем инкубируйте пластины в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе. На следующий день определите КОЕ на миллилитр, подсчитав разведение, которое имеет от 15 до 30 различных колоний в каждой капле, и рассчитав до вашего фактического жизнеспособного инокулята NTHI, чтобы собрать общее количество клеток, ассоциированных с бактериями. Трижды промыть апикальную поверхность дыхательных путей 200 микролитрами DPBS без кальция или магния.

Затем наклоните вставку и смойте остатки поддерживающей среды с базальной мембраны. Поместите промытый вкладыш в свежую шестилуночную пластину и добавьте 250 микролитров стерильного, 1%-ного раствора сапонина на апикальную поверхность каждой ткани. Верните тарелку в инкубатор на 10 минут, пока пластина инкубируется.

Настройте пробирки для серийного разведения, заполнив каждую пробирку для разведения 900 микролитрами PBSG. Затем сотрите ткань с мембраны с помощью наконечника пипетки P 1000 движением вперед и назад, а затем круговыми движениями удалите ткань с краев вставки. Затем с помощью стерильного наконечника для пипетки P 1000 большого диаметра поместите суспензию в пустую пробирку эйнора объемом 1,5 миллилитров.

Теперь добавьте 250 микролитров DPBS на апикальную поверхность вкладыша, а затем осмотрите вкладыш с помощью инвертированного фазово-контрастного микроскопа, чтобы определить, остается ли какая-либо ткань для забора. Добавьте суспензию в трубку эйнора и энергично добавьте 500 микролитров DPBS. Ввергните клеточную суспензию в течение одной минуты.

Затем с помощью стерильного одномиллилитрового шприца с иглой 26 калибра. Аспирируйте суспензию в шприц через иглу. Медленно пропустите суспензию через иглу три раза, стараясь не создать пузыри.

Затем энергично переведите суспензию еще на минуту. Затем с помощью наконечника пипетки большого диаметра переведите 100 микролитров суспензии в первую пробирку для разведения. Энергично поворачивайте трубку в течение пяти секунд, а затем сделайте от одного до 10 последовательных разбавляющих пластин для разведения на шоколадных агаровых пластинах.

Затем инкубируйте планшеты в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе для жизнеспособного количества бактерий и сбора внутренних бактерий. Промойте каждую вставку только три раза с 200 микролитрами DPBS. Замените базальную поддерживающую среду на среду, содержащую 100 микрограммов на миллилитр гентамицина сульфата, а затем добавьте 300 микролитров поддерживающей среды, содержащей гентамицин, на апикальную поверхность.

Верните вкладыши в инкубатор на один час, пока вкладыши инкубируются, предварительно прогрейте немного DPBS. Затем удалите с апикальной поверхности гентамицин, содержащий поддерживающую среду. Затем тщательно промойте апикальную поверхность и базальную мембрану вставок с помощью предварительного подогрева DPBS.

Наконец, повторите только что продемонстрированную процедуру очистки и сбора урожая, прежде чем выполнять серийное разведение и осаждение интернализованных бактерий на этом рисунке. Сравнение изображений неинфицированных тканей эпидыхательных путей с помощью сканирующего электронного микроскопа слева с пятидневными инфицированными NTHI тканями дыхательных путей справа. Можно видеть, что долгосрочное совместное культивирование с NTHI не приводит к значительному повреждению апикальных тканей, что подчеркивает полезность модели эпи дыхательных путей.

Здесь показан график, показывающий количество NTHI, усвоенных с течением времени во время совместной культуры эпидыхательных путей. Штамм R 2 8 6 6 инокулировали примерно один раз по 10 седьмых КОЕ на одну вставку. Затем были собраны и пронумерованы внутренние бактерии в каждый указанный момент времени.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как проводить долгосрочное совместное культивирование NTHI с первичным гормоном дыхательными тканями с использованием модели A PRE.