Метод маркировки сосудистую в эмбриональных мышей

Общая цель данного эксперимента заключается в определении влияния специфических генетических мутаций на развитие и структуру сосудов. Для этого эмбрион и внезародышевые ткани препарируют совместно, чтобы получить подходящий образец для инъекции. Затем в лицевую вену вводится флуоресцентный краситель для маркировки неповрежденной сосудистой сети.

Затем эмбрион подготавливают к анализу. В завершение выполняют цельноплодовое монтирование или делают срезы маркированного сосудистого русла; изображение демонстрирует трехмерную структуру нормальных сосудов, полученную с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии цельных препаратов или срезов тканей. Впервые идея этого метода возникла у меня, когда я стремился определить временной этап развития, на котором периферические сосуды соединяются с тимусом посредством ангиогенеза.

Для начала подготовки FXI dextran или GS L one I selectin B four в PBS в пробирку объемом 1,5 мл добавьте 100 µL стокового 1,25 mM раствора fast green в PBS к FXI dextran или 180 µL к GS L one I select B four, чтобы растворы приобрели видимый синий цвет. Затем прогрейте пробирку до 37 °C.

Выполните диссекцию эмбрионов на стадиях от E 14.5 до E 18.5 вместе с желточными мешками, оставив неповрежденным стебель Аллена Тоика. Перенесите эмбрионы в новую чашку Петри и погрузите их в PBS при комнатной температуре. Затем расположите эмбрион таким образом, чтобы получить сагиттальный вид морды.

Затем с помощью микродиссекционных пинцетов осторожно захватите эмбрион в области головы. Используя иглу 30-го калибра, введите 50 µL FXI dextran или GS L one I selectin B four в лицевую вену, направляя иглу к затылочной части головы. Когда краситель станет виден в пупочной вене, извлеките иглу и отделите эмбрион от плаценты.

Токсический сток. Оставьте эмбрион в PBS при комнатной температуре на две-три минуты, чтобы краситель распределился по всему организму. После того как краситель распределится по всему эмбриону, возьмите образцы кожи из областей конечностей, спины и живота.

Промойте образцы кожи в холодном PBS и зафиксируйте их в 4% паральдегидном PBS в течение двух часов. Затем промойте их трижды по 10 минут в прозрачных флаконах объемом четыре миллилитра с двумя миллилитрами холодного PBS. Поместите образцы кожи на предметные стекла, добавьте по 100 microliters среды для заключения на каждое стекло и накройте покровным стеклом.

Дайте предметным стеклам высохнуть в темноте перед визуализацией. Для получения изображений сосудов кожи с более высоким разрешением можно провести просветление в BABB с последующей конфокальной микроскопией. Чтобы подготовить ткани к криосекционированию, подвергните целые эмбрионы мгновенной заморозке в жидком азоте. Нанесите OCT на блок для сечения и зафиксируйте эмбрион.

Разрежьте замороженную ткань на срезы толщиной 10 micron и поместите их на предметные стекла. Фиксируйте срезы в ацетоне от пяти до 10 минут, затем трижды промойте их в холодном TBS, после чего выдержите в 10%Donkey serum в TBS в камере влажности. При комнатной температуре нанесите по 100 microliters первичных антител на каждый срез.

В данном примере для маркировки эндотелия используются антитела крысы к US CD 31, а для маркировки периваскулярных клеток — антитела козы к US P-D-G-F-R beta, чтобы обеспечить равномерное распределение антител по всему срезу. Накройте предметные стекла индивидуально нарезанными полосками парафильма. Инкубируйте стекла в камере влажности при температуре 4 °C в течение одного часа или в течение ночи.

Затем трижды промойте срезы в холодном TBS. Инкубируйте с 100 µL соответствующих вторичных антител в течение как минимум 30 минут. В завершение трижды промойте в холодном TBS. На каждое предметное стекло нанесите 100 µL среды для заключения препаратов и накройте покровным стеклом.

Дайте предметным стеклам высохнуть в темноте. Для вибротомирования выделите доли тимуса из эмбрионов и промойте в холодном PBS. Фиксируйте ткань в 4% паральдегидном PBS при комнатной температуре в течение двух часов.

После промывки образцов в PBS Triton X заполните небольшой пластиковый картридж 4% низкоплавящим агарозовым PBS. Поместите образцы в агарозовый PBS, убедившись, что ткань соприкасается с дном картриджа. Оставьте агарозу для затвердевания на льду.

Затем с помощью лезвия бритвы удалите излишки агарозы. Нанесите клей на блок VIBRAM и прикрепите образец к блоку. Налейте холодный PBS в водяную баню Vibram до тех пор, пока образец и лезвие не будут полностью погружены.

Установите скорость и амплитуду. Амплитуду следует уменьшить. Если срезы разрушаются из-за чрезмерного перемешивания, сделайте 50 срезов ткани.

Затем с помощью пинцета перенесите срезы в холодный PBS в 24-луночный микропланшет и заблокируйте их в 500 µL 10% сыворотки осла в PBS Triton X в течение 30 минут. После добавления первичных антител, таких как анти-CD 31 и анти-P-D-G-F-R beta, инкубируйте в закрытом микропланшете при температуре 4 °C в течение восьми часов или в течение ночи. Затем промойте трижды в PBS Triton X в течение общего времени восьми часов при 4 °C.

После повторного блокирования срезов и инкубации с вторичными антителами промойте образцы трижды в PBS Triton X в течение восьми часов при температуре 4 °C. Затем зафиксируйте образцы повторно в 4% паральдегидном PBS в течение 30 минут на льду и промойте еще трижды в PBS Triton X в течение 30 минут на льду. Дегидратируйте образцы, используя серию растворов methanol PBS Triton X с возрастающей концентрацией метанола, по 10 минут на каждом этапе.

Затем замените 100% метанол свежим метанолом и инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре. Поместите образец на предметное стекло с углублением и залейте его раствором BABB и метанола в соотношении один к одному. Инкубируйте образцы от 10 до 15 минут.

Затем замените раствор на 100% BABB и инкубируйте при комнатной температуре от 10 до 15 минут или до просветления образца. Накройте покровным стеклом и загерметизируйте двумя-тремя слоями лака для ногтей. Дайте лаку затвердеть в темноте при комнатной температуре.

Образец можно хранить при температуре 4 °C, однако съемку следует провести в течение 12–24 часов. Выполните получение изображений замороженных срезов толщиной 10 мкм с помощью конфокального микроскопа, используя объектив Plan-Apochromat 20x/0.8 и лазерные линии 633, 488 и 543 нм. Получите конфокальные Z-срезы толщиной 1 мкм для срезов в парафине толщиной 50 мкм, используя объектив Plan-Apochromat 10x/0.4 и лазерные линии 488, 543 и 633 нм. Реконструируйте серийные Z-срезы с помощью программного обеспечения для анализа изображений Zeiss ZEN или аналогичного ПО. Эффективное мечение эмбриональных сосудов имеет решающее значение для оценки дефектов кровеносных сосудов у эмбрионов мышей. На этих рисунках показано специфическое мечение сосудов тимуса на стадии E 16.5 и совместное мечение с использованием L-селектина.

B four инъецированных эмбрионов с CD 31, а также окрашивание правого и левого желудочков. В данных экспериментах использовался протокол GSL one I selectin B four для криосрезов. Здесь показано целое окрашивание сети кровеносных сосудов кожи мышей E 16.5 после выполнения данной процедуры.

Для получения ответов на дополнительные вопросы, такие как «Как клетки крови и стромальные клетки взаимодействуют с сосудистой сетью в эмбрионе мыши как в нормальных, так и в патологических условиях?», могут быть использованы другие методы, например совместное мечение стромальных клеток и клеток крови вместе с сосудами.