Изменение направления и ориентации электрического поля во время применения электрических импульсов Улучшает плазмиды перенос генов В пробирке
12 сентября 2011 г.
Гена трансфекции электропорацией улучшается примерно в два раза, когда ориентация электрического поля изменяется во время нанесения импульса, а жизнеспособность клеток не влияет. Увеличение трансфекции гена обусловлена увеличением мембраны области, которая производится компетентным для ДНК вступления в клетке.
Электродальный перенос генов — это физический метод доставки генов в клетки путем подачи коротких и интенсивных электрических импульсов. При успешном электродальном переносе генов происходят несколько этапов: формирование комплекса между ДНК и клеточной мембраной, транслокация ДНК через пермеабилизированную мембрану, перенос ДНК из цитоплазмы в ядро и последующая экспрессия гена. Для достижения максимальной эффективности трансфекции генов используются различные протоколы электрического импульса.
Одним из таких способов является изменение ориентации электрического поля во время подачи импульсов. В данном видео мы демонстрируем разницу в эффективности переноса генов через электроды при подаче всех импульсов в одном направлении и при их чередовании. Эксперименты по изменению ориентации электрического поля проводились на клетках яичника китайского хомячка, линии CHO-K1.
Выполните следующие действия: культивируйте клетки в культуральном флаконе в инкубаторе в течение 24 часов. В день эксперимента подготовьте клеточную суспензию с помощью трипсина в 0.25% растворе трипсина в ЭДТА и подсчитайте количество клеток. Центрифугируйте клетки в течение пяти минут при 1000 об/мин при температуре 4 °C и ресуспендируйте клеточный осадок в натрий-фосфатном буфере ISO OSM Miller до плотности 5 миллионов клеток на мл. Перенесите образец в соответствующий планшет; клетки подвергают воздействию электрического поля в наконечнике с интегрированными электродами, подключенным к прототипу генератора высокого напряжения.
Данные электроды позволяют прикладывать относительно однородное электрическое поле в различных направлениях. Кончик электрода и генератор были разработаны в лаборатории биокибернетики факультета электротехники Университета Луана. Добавьте плазмиду E-G-F-P-N в суспензию клеток до концентрации 10 micrograms per milliliter.
Тщательно перемешайте клетки с плазмидной ДНК и инкубируйте смесь в течение двух-трех минут при комнатной температуре перед подачей электрических импульсов. Наберите 100 µL клеточной суспензии в наконечник пипетки со встроенными электродами. В данном эксперименте с помощью прототипа высоковольтного генератора подается серия из восьми прямоугольных импульсов; в первом протоколе используются различные режимы электрического поля.
Все импульсы подаются в одном направлении, тогда как во втором протоколе импульсы подаются с изменением ориентации электрического поля. Второй протокол может быть использован только с подходящим генератором импульсов, который позволяет подавать электрические импульсы в разных направлениях. Сразу после подачи импульсов перенесите клетки с кончика пипетки в шестилуночный планшет и добавьте эмбриональную бычью сыворотку.
Инкубируйте клетки в объеме 25% от объема образца в течение пяти минут при 37 °C. Для восстановления целостности клеточных мембран добавьте в каждую лунку шестилуночного планшета по 2 mL среды HAMF 12 и инкубируйте клетки в течение 24 часов при 37 °C в увлажненной атмосфере с 5% CO2 в инкубаторе. Эффективность электропереноса гена определяется как процент клеток, экспрессирующих GFP через 24 часа после подачи импульса.
Клетки наблюдают с помощью флуоресцентного микроскопа, используя программу для сбора данных. Установите длину волны возбуждения 488 нм и выберите подходящий полосовой фильтр для получения изображения с зеленой флуоресценцией, чтобы обнаружить клетки, экспрессирующие GFP. Сделайте как минимум пять снимков в фазовом контрасте и в зеленой флуоресценции при 20-кратном увеличении.
При задатном увеличении объектива подсчитывают количество клеток на изображении в фазовом контрасте и количество клеток, экспрессирующих GFP, на изображении в зеленой флуоресценции. Процент эффективности электропереноса генов определяют путем деления количества клеток, экспрессирующих GFP, на общее количество клеток на соответствующем изображении. Представлен процент клеток, экспрессирующих GFP, при подаче всех импульсов в одном направлении и при подаче импульсов с изменением ориентации электрического поля. При изменении ориентации электрического поля процент клеток, экспрессирующих GFP, значительно увеличивается.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании изучается трансфекция генов посредством электропорации, при этом особое внимание уделяется влиянию ориентации электрического поля на эффективность трансфекции. Результаты показывают, что изменение направления электрического поля во время подачи импульсов может привести к двукратному увеличению скорости трансфекции генов без ущерба для жизнеспособности клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Генная терапия
- Клеточная биология
- Методы электропорации
Теоретические сведения
- Электротрансфер генов — это метод доставки генов в клетки.
- Он основан на применении коротких интенсивных электрических импульсов для облегчения проникновения ДНК.
- Для успешной трансфекции ДНК должна пересечь клеточную мембрану и попасть в ядро.
- Различные протоколы электрических импульсов могут повысить эффективность трансфекции.
Цель исследования
- Оценить влияние ориентации электрического поля на эффективность трансфекции генов.
- Определить, влияет ли изменение ориентации на жизнеспособность клеток.
- Продемонстрировать данный процесс на примере клеток яичника китайского хомячка (CHO).
Используемые методы
- Воздействие электрических импульсов на клетки CHO.
- Сравнение эффективности трансфекции при различных ориентациях электрического поля.
- Оценка жизнеспособности клеток после трансфекции.
- Анализ проникновения ДНК в клетки и последующей экспрессии генов.
Основные результаты
- Эффективность трансфекции генов увеличилась примерно в два раза при изменении ориентации электрического поля.
- Значительного влияния на жизнеспособность клеток не наблюдалось.
- Увеличение площади мембраны способствовало более интенсивному проникновению ДНК.
- Продемонстрирована эффективность различных протоколов электрического импульса.
Выводы
- Изменение ориентации электрического поля во время подачи импульсов значительно повышает эффективность трансфекции генов.
- Данный метод может быть оптимизирован без ущерба для жизнеспособности клеток.
- В ходе дальнейших исследований могут быть изучены дополнительные протоколы для улучшения доставки генов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Оптимизация ориентации электрического поля при электропорации повышает эффективность переноса плазмидных генов, предлагая невирусную стратегию увеличения выхода трансфекции в рабочих процессах ранней валидации мишеней и идентификации соединений-лидеров. Этот подход способствует механистическому снижению рисков за счет увеличения проникновения ДНК благодаря расширению мембранной проницаемости без ущерба для жизнеспособности клеток, что повышает прогностическую достоверность доклинических моделей. Данный метод обеспечивает воспроизводимую и масштабируемую доставку генов для разработки анализов и фенотипического скрининга в биофармацевтических исследованиях и разработках.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Увеличивает площадь мембраны, доступную для проникновения ДНК, что повышает эффективность трансфекции и способствует функциональной валидации мишеней в исследованиях экспрессии рекомбинантных белков.
- Практическая ценность: Обеспечивает стабильную доставку плазмид в популяции клеток, снижая вариабельность при тестировании гипотез на ранних этапах и уточнении сигнальных путей.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Обеспечивает количественный флуоресцентный анализ эффективности переноса генов, совместимый с платформами высокопроизводительного скрининга.
- Операционная ценность: Стандартизирует параметры электропорации за счет использования интегрированных наконечников электродов и программируемых генераторов импульсов, что повышает воспроизводимость анализа в разных лабораториях.
- Стратегическая ценность: Обеспечивает масштабируемую подготовку трансфицированных клеточных линий для последующего анализа взаимодействия с мишенями и исследования биомаркеров.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Поддержание жизнеспособности клеток после трансфекции, что позволяет проводить лонгитюдные исследования экспрессии генов и фенотипических эффектов в системах, релевантных для изучения заболеваний.
- Практическая ценность: Облегчает создание стабильных или транзиторно трансфицированных доклинических моделей с использованием клеток CHO, которые широко применяются в качестве хозяина для производства биопрепаратов и анализа сигнальных путей.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Этот метод вписывается в континуум процесса поиска лекарственных средств — от валидации мишени до идентификации ведущих соединений, где требуется эффективная доставка генов для оценки функции мишени и модуляции сигнальных путей в клеточных моделях.
- Открытия в биологии: Помогает в проверке гипотез, обеспечивая надежную гиперэкспрессию или нокдаун интересующих генов в клетках млекопитающих.
- Скрининг: Обеспечивает стандартизированные количественные результаты трансфекции, которые позволяют сравнивать генетические конструкции или регуляторные элементы.
- Аналитика: Позволяет рассчитывать показатели эффективности в процентах (GFP+ клетки/общее количество клеток), что дает возможность проводить статистическое сравнение различных протоколов импульсного воздействия.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает преемственность с доклиническими исследованиями путем получения жизнеспособных трансфицированных клеток, пригодных для дальнейшей валидации в 3D-моделях или системах совместного культивирования.
- Корпоративное повторное использование: Представляет собой многократно используемый метод электропорации, применимый в рамках нескольких проектов, требующих доставки плазмид в адгезивные или суспензионные клеточные линии.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов результатов доставки генов за счет увеличения эффективности трансфекции путем биофизической оптимизации параметров импульса.
- Практическая ценность: улучшает воспроизводимость и стандартизацию процедур переноса генов благодаря использованию определенных последовательностей импульсов и контролю ориентации поля.
- Стратегическая ценность: снижает биологический риск при валидации мишеней, обеспечивая достаточную экспрессию трансгена для фенотипической оценки, что минимизирует количество ложноотрицательных результатов.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию генетических мишеней с учетом рисков на основе достижимых уровней экспрессии в клеточных анализах.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами клеток млекопитающих, preparation плазмид и флуоресцентной микроскопией для оценки эффективности трансфекции.
- Зависит от наличия высоковольтных импульсных генераторов с возможностью программируемого изменения ориентации электрического поля и совместимых наконечников со встроенными электродами.
- Необходимо стандартизировать параметры импульса (напряжение, длительность, количество) и плотность клеток в разных экспериментах для обеспечения сопоставимости результатов.
- Требуется оптимизация соотношения ДНК к количеству клеток и времени инкубации для баланса между эффективностью трансфекции и клеточным стрессом.
- Применимо только к адгезивным или суспензионным клеточным линиям, совместимым с электропорацией; для первичных или чувствительных клеток могут потребоваться альтернативные методы доставки.
