Изображениями феромонов зондирования в мышь вомероназального острого Подготовка фрагментов тканей

Общая цель данной процедуры — получение острого среза ткани рылового органа (RO) или вомероназального органа (VNO) мыши для проведения экспериментов по визуализации кальция в субпопуляциях и/или отдельных нейронах живой ткани. Это достигается путем извлечения VNO из носа мыши с последующим микродиссекированием органа из хрящевой капсулы под диссекционным микроскопом в холодном A CSF. Затем изолированный VNO располагают вертикально в блоке агара и с помощью микротома делают острые корональные срезы ткани для проверки целостности препарата.

После проведения иммуногистохимического анализа несколько срезов исследуют с помощью конфокального микроскопа. Другие срезы насыщают кальций-чувствительным красителем, после чего проводят перфузию предполагаемыми феромонными лигандами и фиксируют активацию нейронов методом кальциевого имиджинга. Данный метод позволяет решить ключевые вопросы в области обоняния.

Например, в рудиментарном органе обоняния экспрессируются сотни феромонных рецепторов, однако лиганды большинства из них остаются неидентифицированными. Феромонные рецепторы крайне сложно экспрессировать в гетерологичных системах. Нам потребовалось разработать эффективный метод анализа in vivo для сопоставления конкретных феромонов с определенными рецепторами.

Мы можем использовать трансгенных мышей, у которых специфическая субпопуляция нейронов экспрессирует неизвестные рецепторы и может быть идентифицирована по экспрессии GFP. Мы также можем использовать данный анализ для фармакологического исследования ионных каналов и ферментов, участвующих в каскаде трансдукции Fairmont, демонстрируя данную процедуру. Сегодня со мной будут Джулиан и Фабиан, два исследователя из моей лаборатории, перед началом диссекции.

Приготовьте свежий охлажденный искусственный спинномозговой液 (CSF), насыщенный oxy carb, смешав все ингредиенты, кроме хлорида кальция. Насытите раствор, непосредственно продувая его oxy carb. Затем добавьте хлорид кальция и доведите до нужного объема дважды дистиллированной водой.

Храните раствор A CSF на льду до использования. После эвтаназии и декапитации взрослой мыши подготовьте чашку Петри с холодным, непрерывно оксигенированным и карбонизированным A CSF. После удаления нижней челюсти поместите голову мыши в чашку Петри.

Расположите голову мыши под диссекционным микроскопом, чтобы визуализировать нёбо. Затем горизонтально разрежьте верхнюю часть нёба микроножницами, после чего удалите слизистую оболочку нёба микродиссекционными пинцетами. Увлажните и очистите обнажившуюся полость с помощью A CSF.

Отрежьте верхнюю и нижнюю части носовой перегородки. Затем аккуратно извлеките носовую перегородку, содержащую VNO, и поместите её вертикально непосредственно в чистый A CSF. Разделите две части VNO с помощью микродиссекционных пинцетов.

Идентифицируйте хрящевую капсулу VNO и осторожно удалите ее, убедившись, что все фрагменты хряща удалены. Здесь показаны изолированный VNO, фрагменты хряща и недиссецированный VNO. Сначала приготовьте 3% низкоплавкий агар, затем организуйте рабочее пространство с необходимыми инструментами. Заполните форму для заливки агаром и перед погружением диссецированного VNO убедитесь, что температура ниже 41 °C. Расположите ткань вертикально для получения корональных срезов.

Поместите форму для заливки на лед на одну минуту, пока агар не затвердеет. Через одну минуту извлеките блок агара, обрежьте его до параллелепипеда, а затем закрепите на предметном стекле микротома. Выполните корональные срезы VNO на микротоме со скоростью 0,5 millimeters per second, амплитудой 0,7 millimeters и толщиной 100 micrometers в холодном CSF.

Соберите срезы ткани с помощью кисточки и поместите их в планшет для культивирования тканей, заполненный холодным A CSF, чтобы подтвердить структурную целостность собранных срезов ткани, которые затем можно зафиксировать и подвергнуть иммуноокрашиванию на компоненты цитоскелета или другие интересующие белки. Здесь иммуноокрашивание на ацетилированный тубулин фиолетовым цветом демонстрирует структурную целостность среза ткани. Кроме того, наблюдение за специфической популяцией нейронов, в которой определенный рецептор феромонов был помечен GFP, показывает сохранную морфологию нейронов; при работе в темной комнате можно наблюдать нейроны с небольшими овальными телами клеток и длинными дендритами, достигающими поверхности просвета и заканчивающимися микроворсинками.

Инкубируйте срезы VNO в загрузочном растворе холодного A CSF с 7 µM URA 2:00 AM и 0,1% onic в течение одного часа при 37 °C. После завершения инкубации храните загруженные срезы на льду в условиях оксикарбонизации до момента использования. С помощью кисти поместите загруженные срезы в перфузионную камеру с A CSF и закрепите их с помощью фиксатора для тканевых срезов.

Поместите перфузионную камеру на предметный столик микроскопа установки для кальциевого имиджинга и обеспечьте непрерывную перфузию оксикарбонизированным A CSF при комнатной температуре. Наблюдайте за загруженными срезами VNO, используя длины волн флуоресценции, соответствующие красителю, которые составляют 340–380 нм для 4O2:00 AM. Используйте соответствующее программное обеспечение для записи изменений соотношения внутриклеточного кальция. Для индукции хемостимуляции необходима система перфузии.

Здесь представлен корональный срез ткани vno мыши, у которой субпопуляция нейронов, экспрессирующих феромонный рецептор V one RB two, также экспрессирует GFP; проведен иммуногистохимический анализ на белок ацетилированный тубулин, который показан фиолетовым цветом. При большем увеличении среза видна сохранность целостности ткани. Показаны нейроны с длинными дендритами, достигающими поверхности просвета; экспрессия структурного белка наблюдается в дендритных головках и микроворсинках для проведения кальциевого имиджинга.

Срезы тканей, нагруженные FU, сначала визуализируют с помощью фазового контраста Хоффмана, чтобы определить интересующую область, начиная с кровеносного сосуда (первая белая стрелка); затем наблюдатель медленно перемещается к просвету (вторая белая стрелка) и нейроэпителиальной области. Овальное тело клетки RO-носового нейрона. Третью белую стрелку можно идентифицировать по его длинному и тонкому дендриту.

Четвертая белая стрелка, направленная в просвет, указывает на дендритный бугорок нейрона. Пятая белая стрелка указывает на микроворсинки, контактирующие с клетками, нагруженными феромонами RA; здесь показано, что при последовательном освещении на длинах волн 340 нм и 380 нм соотношение интенсивностей флуоресценции соответствует изменениям внутриклеточного кальция в выбранных нейронах, отмеченных черным, красным и синим кружками. ATP используется для определения жизнеспособности нейронов.

Обратите внимание на диапазон кальциевых ответов, наблюдаемых в трех выбранных нейронах, и на тот факт, что нейрон номер два (красный круг) не реагирует на TP и, следовательно, будет исключен из дальнейшего анализа. Затем проводится хемостимуляция с использованием мочи и смеси феромонов мыши при наблюдении в глубине среза ткани. Можно локализовать субпопуляцию нейронов, экспрессирующих как GFP, так и рецептор V1RR2.

Здесь нейрон, экспрессирующий как GFP, так и рецептор V1RB2, показан рядом с нейроном, не экспрессирующим V1RB2. Обе клетки нагружены URA-2:00 AM, и в нейроне, экспрессирующем V1RB2, наблюдается кальциевый спайк в ответ на перфузию лиганда этого рецептора — 2-hepnon. Интересно, что нейрон, не экспрессирующий V1RB2, также реагирует на 2-hepnon, что демонстрирует сложность кодирования феромонов в VNO.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как извлекать и микродиссецировать орган Мар у мыши для подготовки острых срезов ткани. Данный протокол также может быть адаптирован для физиологических исследований с использованием других кальциевых красителей и конфигураций микроскопов. Желаем успехов в вашем эксперименте.