Колоректального рака на поверхности клеток белков профилировки с Microarray антитела и флуоресценции мультиплексирования

Общая цель следующего эксперимента заключается в использовании микрочипа с антителами DOT scan для молекулярного профилирования поверхностных антигенов в ткани колоректального рака. Кроме того, применяется флуоресцентное мультиплексирование для различения типов клеток с определенными профилями внутри смешанной популяции. Кластеры дифференцировки или CD-антигены были идентифицированы как потенциальные прогностические или метастатические биомаркеры при колоректальном раке.

Эти антигены являются идеальными биомаркерами, поскольку их экспрессия часто меняется по мере прогрессирования опухоли или при взаимодействии с другими типами клеток. В данном видео мы используем антительный микрочип DOT scan для захвата живых клеток с помощью экспрессируемых поверхностных антигенов. Антительный микрочип DOT scan представляет собой стеклянный предметный слайд с слоем нитроцеллюлозы.

Панель антительного микромассива DOT scan ограничена ориентирами в виде точек, состоящих из CD 29 и CD 44. Дублирующие массивы также нанесены в виде точек по обеим сторонам основного массива. Первая панель состоит из исходных 82 антител микромассива DOT scan для лейкоза, а дополнительные 40 антител были отобраны на основании прогностического потенциала в качестве сателлитного микромассива для колоректального рака.

Последняя панель состоит из изотипических контрольных антител. Здесь ткани колоректального рака и нормальная слизистая оболочка кишечника подвергаются дигестии и фильтрации для получения жизнеспособной суспензии одиночных клеток. Суспензию можно заморозить или сохранить для последующего использования.

Суспензия клеток используется для захвата клеток на микрочипе с антителами DOT scan; антигены, экспрессируемые различными подтипами клеток, анализируются с помощью флуоресцентного мультиплексирования. Полученные профили экспрессии демонстрируют значительное различие в экспрессии антигенов между клетками колоректального рака и нормальной слизистой оболочкой кишечника. Эта разница также отражается в популяции лейкоцитов, ассоциированных с опухолью.

Иерархическая кластеризация нескольких профилей опухолей демонстрирует группировку сигнатур заболевания в соответствии со стадиями колоректального рака. Здравствуйте, я Джерри из Школы молекулярных биобиологических наук Сиднейского университета, Австралия, и сегодня я покажу вам эксперимент по профилированию поверхностных антигенов в тканях колоректального рака. С помощью антительного микромассива Dot Scan и флуоресцентного мультиплексирования микромассивы Dot Scan позволяют проводить профилирование примерно 140 поверхностных антигенов на живых раковых клетках совместно с соответствующими воспалительными лейкоцитами.

Подмножества клеток, захваченных на микрочипах, можно дифференцировать с помощью флуоресцентно меченных антител, которые связываются с высокоэкспрессируемым маркерным антигеном на интересующих клетках. С помощью соответствующих флуоресцентных меток на антителах с тремя различными специфичностями на одном микрочипе можно профилировать до трех различных подмножеств клеток. Анализ с использованием микрочипов DOT scan представляет собой относительно простой метод, который уже применялся для профилирования поверхности клеток при нескольких видах рака.

Ключевой особенностью сканирования методом диффузионно-оптической томографии (DOT) является способность захватывать живые клетки с помощью их поверхностных антигенов, благодаря чему полученный паттерн связывания отражает профиль поверхности клетки. Поверхностные антигены играют важную роль в развитии и метастазировании опухоли, а также в воспалительной реакции организма при борьбе с раком. Обширные профили поверхности или иммунофенотипы могут быть использованы в качестве биомаркеров заболевания для улучшения классификации рака, что позволяет подобрать оптимальное лечение после хирургического вмешательства.

Итак, приступим. В данном эксперименте образцы клинических опухолей колоректального рака степеней от A до D собираются в буфер Хэнкса. Для начала с помощью двух скальпелей аккуратно разрежьте опухоль на срезы толщиной один миллиметр.

Поместите срезы в раствор 2% коллагеназы четвертого типа и 10% ДНК для переваривания. Участки нормальной слизистой оболочки кишечника того же пациента собирают на расстоянии 10 сантиметров от места расположения первичной опухоли. Этот образец служит контролем и обрабатывается точно так же, как и образец опухоли.

Дигестия опухоли проводится при 37 °C в течение одного часа для стимуляции распада соединительной ткани; ДНКаза удаляет ДНК из поврежденных клеток. После инкубации суспензию ткани пропускают через металлическую сетку, промывая образец буфером Хэнкса, при этом для облегчения прохождения клеток через сетку используют поршень от шприца объемом 10 мл. Эту процедуру повторяют несколько раз, пока большая часть клеток не пройдет через сетку.

Сетка отделяет клетки от любого непереваренной соединительной ткани. Затем дополнительно профильтруйте клеточную суспензию, набрав ее в шприц объемом 10 mL и пропустив через фильтр fcon 200 µm, а затем через фильтр fil con 50 µm. Эти фильтры с более мелкими порами должны обеспечить удаление излишков слизи или ДНК, а также разрушение клеточных кластеров для получения жизнеспособной суспензии одиночных клеток.

Аналогичная обработка проводится для нормальной слизистой оболочки. Было обнаружено, что нормальная слизистая имеет тенденцию содержать больше соединительной ткани и, как следствие, требует большего количества промывок перед центрифугированием клеточной суспензии через сетку при 410 G и 20 °C в течение пяти минут. Для подготовки к криоконсервации осадок клеток суспендируют в 750 µL эмбриональной сыворотки теленка, после чего добавляют равные объемы эмбриональной сыворотки теленка с DMS.

Добавьте раствор в указанной концентрации DMS. Добавляйте раствор по каплям при постоянном перемешивании, затем перенесите аликвоту супернатанта в криопробирку и поместите ее в термоизоляционный контейнер. Эти образцы можно хранить при температуре -80 °C до одного года.

Изоляция и DMSO должны обеспечить медленное высвобождение клеток без их разрыва. Побочным эффектом такого хранения является лизис популяции эритроцитов. К счастью, они нам не нужны.

Для проведения эксперимента извлеките образцы из хранилища и быстро перенесите их. В водяной бане при температуре 37 °C ресуспендируйте клеточную суспензию в 10 мл буфера Хэнкса; буфер поможет разбавить 10% DMSO и фекальную сыворотку теленка; центрифугируйте клетки в течение пяти минут при 410 ×g при температуре 20 °C.

Затем декантируйте супернатант и ресуспендируйте осадок в 500 µL буфера Хэнкса; в процессе замораживания и оттаивания некоторые клетки могут разрушиться, что приведет к высвобождению ДНК в суспензию. Чтобы устранить эту проблему, инкубируйте образец с 0,1% DNase при комнатной температуре. В течение этого времени можно провести подсчет жизнеспособности клеток.

Смешайте равные объемы триам синего с 10 µL клеточной суспензии и перенесите 10 µL полученной смеси в счетчик клеток. Под микроскопом здоровые и жизнеспособные клетки выглядят прозрачными. С другой стороны, нежизнеспособные клетки с поврежденными мембранами будут окрашены в синий цвет.

Для захвата клеток с помощью антител при сканировании DOT MICRORAY требуется минимум 4 миллиона жизнеспособных клеток. После обработки ДНК клетки промывают второй раз 10 мл буфера Хэнкса и центрифугируют при 410 G в течение пяти минут при температуре 20 °C.

Мы суспендируем итоговый осадок клеток в 200 µL среды RPMI. Эта среда содержит больше питательных веществ, чем буфер Хэнкса, и используется для облегчения захвата клеток на антительном микрочипе при сохранении жизнеспособности клеток. Антительный микрочип для сканирования точек колоректального рака состоит из 140 различных антительных точек, продублированных на нитроцеллюлозе.

Каждая точка на матрице содержит 10 нанолитров моноклональных антител к антигену клеточной поверхности. Для подготовки антительного микрочипа погрузите его в кювету с PBS, чтобы увлажнить нитроцеллюлозу, затем протрите стеклянный край матрицы салфетками Kim wipes. Будьте осторожны, чтобы не касаться нитроцеллюлозного участка; поместите микрочип в кювету и нанесите суспензию клеток на нитроцеллюлозу с помощью дозатора.

Равномерное распределение клеточной суспензии обеспечит возможность захвата клеток всеми антителами. Инкубируйте микроматрицу при 37 °C в течение одного часа. В процессе инкубации различные клетки будут оседать и вступать в контакт с антителами на ячейках матрицы.

Поверхностные антигены, соответствующие антителам, будут связываться и захватывать клетки после инкубации. Удалите несвязавшиеся клетки, осторожно погружая массивы в три смены свежего раствора PPS. Фиксируйте захваченные клетки в 10% растворе формальдегида в PPS.

Осторожно перенесите пипеткой достаточное количество фиксатора, чтобы полностью покрыть участок с нанесенными на нитроцеллюлозную мембрану образцами. Инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем трижды погрузите микрочипы в свежий PBS.

Оставьте массивы замачиваться в PBS на 30 секунд при каждой промывке, так как избыточная высота полимера может помешать флуоресцентному мультиплексированию. Теперь мы можем проверить наличие связывания клеток, удерживая микромассив под источником света для проведения более точного анализа. Сканер DOT и соответствующее программное обеспечение для анализа позволяют сканировать паттерн связывания и получать количественные результаты экспрессии антигенов в смешанной популяции клеток.

Программное обеспечение сравнивает интенсивность связывания клеток с фоновым шумом по восьмибитной шкале серого. Единицы интенсивности нормализованы по максимальному значению 256. Для облегчения сравнения между массивами любые положительные значения связывания изотипического контроля вычитаются из показателей антител с соответствующими изотипами IG.

Добавьте 200 µL блокирующего буфера на микрочип и инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре. Для подготовки к флуоресцентному мультиплексированию в 118 µL блокирующего буфера добавьте 10 µL конъюгата CD3 с Fyry и 20 µL конъюгата EPCAM с Alexa. Кроме того, в смесь добавляют 2 µL инактивированной сыворотки лошади для предотвращения неспецифического связывания.

После завершения блокировки буфер для блокировки заменяют на раствор для мультиплексирования и инкубируют в темноте в течение 30 минут. При комнатной температуре в процессе инкубации конъюгированные антитела к CD3 связываются с экспрессирующими CD3 T-клетками, закрепленными на матрице, в то время как конъюгированные антитела к EPAM связываются с эпителиальными клетками или клетками колоректального рака на матрице. Затем микроматрицу промывают трижды в свежем PBS и дают высохнуть в темноте перед сканированием на флуоресценцию.

Флуоресценцию детектируют с помощью сканера Typhoon FLA 9000. Профиль FICO сканируют с использованием лазера с длиной волны 532 нм и эмиссионного фильтра 580 BP 30. Alexa 647 сканируют с использованием лазера с длиной волны 633 нм и эмиссионного фильтра 670 BP 30. Полученные флуоресцентные изображения конвертируют в формат tiff для последующего анализа.

С использованием программного обеспечения для DOT-сканирования. Флуоресцентное мультиплексирование позволяет нам различать антигенные профили различных популяций клеток в одном и том же образце ткани. Представленные здесь изображения получены из образца колоректального рака.

На этих трех изображениях представлены оптический скан, флуоресцентный скан клеток, экспрессирующих CD3, и флуоресцентный скан клеток, экспрессирующих EPAM. Результаты микромассива DOT-сканирования должны демонстрировать согласованные паттерны связывания клеток на двух дублирующих предметных стеклах. Интенсивное точечное связывание вдоль края предметного стекла указывает на захват достаточного количества клеток.

Для получения количественных показателей связывания клеток можно создать PDF-отчет. Столбчатая диаграмма, представляющая связывание клеток, демонстрирует различие в экспрессии антигена между нормальной слизистой оболочкой и образцом опухоли.

Оптические результаты дали общее представление об экспрессии антигенов на всех типах клеток в образце, в то время как результаты мультиплексного анализа AAM демонстрируют более четкую картину различий в экспрессии антигенов между нормальными эпителиальными и раковыми клетками. Хотя многие из дифференциально экспрессируемых антигенов в совокупности известны как биомаркеры колоректального рака, они обеспечивают гораздо более точную сигнатуру заболевания для стратификации, чем может дать любой отдельный биомаркер. Результаты мультиплексного анализа CD3 показывают большее количество T-клеток в раковом образце по сравнению с нормальным.

Часто Т-клетки опухоли экспрессируют маркеры активации, что указывает на вероятность того, что данные Т-клетки являются опухоль-инфильтрирующими лимфоцитами или Т-клетками, связанными с воспалением. Масштабный анализ может быть проведен с помощью Multi Experiment Viewer версии 4.4 — программного обеспечения с открытым исходным кодом для построения тепловых карт и анализа данных. Иерархическая кластеризация образцов колоректального рака может быть использована для установления корреляции со стадией заболевания или прогнозом для пациента.

Обширная библиотека сигнатур заболеваний является ценным инструментом для прогнозирования исходов у пациентов с колоректальным раком или при определении тактики послеоперационного лечения. Мы только что продемонстрировали процедуру профилирования экспрессии поверхностных антигенов в смешанной популяции клеток ткани при колоректальном раке с использованием антительного микрочипа DOT scan и мультиплексного флуоресцентного анализа. Важным аспектом данного эксперимента, о котором следует помнить, является необходимость использования свежей ткани; для успешного проведения анализа требуется не менее 4 million жизнеспособных клеток. Благодарим за просмотр этого видео и желаем удачи в ваших экспериментах.