Сфероид Пробирной для измерения TGF-β-индуцированной Вторжение

Анализа количественно измерить трансформирующий фактор роста (TGF)-β-индуцированной вторжения в 3-мерном гели коллагена описано. Этот тест использует преимущества серии MCF10A клеточных линий, которые представляют различные стадии развития рака молочной железы. Этот метод может быть принята для использования с другими клеточными линиями и может быть использован для исследования других возможных активаторов или ингибиторов вторжения.

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы измерить влияние потенциальных регуляторов индуцированной TGF бета-инвазии в трехмерной среде. Это достигается путем предварительного изготовления сфероидов из клеток. Затем PHE встраиваются в коллаген, который обеспечивает 3D-среду.

Затем проводится количественная оценка инвазивной области. Для того, чтобы определить влияние лечения на инвазию, индуцированную TGF бета, результаты показывают, что модуляторы пути TGF-beta влияют на инвазивные свойства стероидов в 3D коллагеновой матрице. Основное преимущество этой техники перед существующими методами, такими как эссе с нуля, заключается в том, что она лучше воспроизводит 3D-среду.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области Т-метров, такие как идентификация новых генов, участвующих в индуцированной бета-индуцированной инвазии учителей. Чтобы приготовить раствор метильных клеток для анализа инвазии, вызванной бета-индуцированием TGF, начните с автоклавирования шести граммов метилцеллюлозы в 500-миллилитровую бутылку, содержащую магнитную мешалку. Растворите метилцеллюлозу в 250 миллилитрах предварительно нагретой смеси D-M-E-M-F 12 без сыворотки в течение 20 минут, добавьте 250 миллилитров смеси сыворотки комнатной температуры D-M-E-M-F 12, содержащей 10% лошадиной сыворотки, на ночь при четырех градусах Цельсия на следующий день, очистите раствор центрифугированием при 5000 г в течение двух часов при четырех градусах Цельсия.

Перелейте прозрачный, высоковязкий раствор в новую пробирку при температуре четыре градуса Цельсия до использования для культивирования phe. Приготовьте 20%-ный раствор метильных клеток, используя 10 миллилитров приготовленного запаса метильных клеток и 40 миллилитров роста. Средняя промывка элементов MCF 10 A дважды с PBS.

Добавьте 0,1% трипсина и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия до тех пор, пока все клетки не отделятся. Ресуспендируйте клетки в 10 миллилитрах питательной среды и подсчитайте клетки с помощью счетчика клеток. Приготовьте суспензию из 10 000 клеток на миллилитр в 20%-ном метил-элементе.

Для каждого условия испытания добавьте 100 микролитров клеточной суспензии в 12 лунок 96-луночной круглой нижней суспензионной пластины. Инкубируйте клетки в течение ночи во влажном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. На следующий день проверяем образование сфероидов.

Сфероиды будут готовы к использованию в течение одного-трех дней. Приготовьте на льду раствор из восьми миллилитров коллагена, одного миллилитра 10 XPBS, одного миллилитра 0,1 нормального гидроксида натрия и трех капель 0,1 нормальной соляной кислоты. Убедитесь, что pH раствора составляет 7,4, обнаружив его на индикаторных полосках.

Отрегулируйте pH, если он выходит за пределы допустимого диапазона. Добавьте 50 микролитров нейтрализованного раствора коллагена в лунки 96-луночной пластины, инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия около 90 минут или пока коллаген не затвердеет. Для каждого тестируемого лиганда готовят раствор лиганда коллагена метилклеток на льду.

Начните с одного миллилитра раствора коллагена на одну процедуру и добавьте 20 нанограммов TGF beta для конечной концентрации пять нанограммов на миллилитр, смешанных с помощью вортексинга. Затем добавьте один миллилитр раствора метильных клеток для конечного объема в два миллилитра и вортекс. Снова для встраивания стероида помещают наконечник пипетки объемом 200 микролитров, на который приходится пять миллиметров и более наконечника, срезанный на пипетке объемом 200 микролитров.

Затем возьмите один сфероид с помощью пипетки. Осторожно выдавите среду в пустую пластину, следя за тем, чтобы сфероид S оставался внутри наконечника. Не отпускайте поршень.

Возьмите 100 микролитров смеси коллагеновых метилклеток и распределите смесь коллагена S-сфероида в лунку с коллагеновым покрытием 96. Луночная пластина заполнена 12 лунками для каждого условия. Дайте коллагену застыть не менее 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия и удалите пузырьки воздуха с помощью наконечника объемом 200 микролитров.

Приготовьте 40 микромолярный раствор бета-ингибитора TGF SB 4 31 542 путем добавления четырех микролитров исходного раствора SB 4 31 542 к одному миллилитру D-M-E-M-F 12, содержащему 1,6% лошадиной сыворотки. Добавьте по 50 микролитров среды с ингибитором в каждую лунку после диффузии. Конечная концентрация ингибитора будет составлять 10 микромоляров.

Сфотографируйте стероид под микроскопом с использованием 40-кратного увеличения, затем инкубируйте в увлажненном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. После двухдневной инкубации сделайте снимки еще раз и измерьте площадь вторгшегося стероида, открыв изображение сфероида в Adobe Photoshop. Расширено и выберите инструмент быстрого выделения.

Указатель мыши при перетаскивании курсора на сфероид превратится в круг со знаком плюса. Программное обеспечение будет распознавать границы сфероида. Если выделена область вне стероида, исключите ее, нажав клавишу Alt или используя инструмент негативного выделения, который является отрицательным знаком на панели инструментов.

Наведите курсор на неправильно выбранную область, и программа удалит ее из выделения. Если выделение области внутри сфероида отменено, ее можно снова включить, перетащив ее при нажатии кнопки Shift. Для более точной работы отрегулируйте размер указателя мыши, изменив диаметр кисти на панели инструментов.

Чтобы рассчитать площадь всех активных выборок, выберите меру анализа в строке меню. Появится окно записи измерений, в котором будет указано имя файла и область выбора в пикселях. Если в пределах одного сфероида измеряется несколько выборок, то в первой строке будет показана сумма всех площадей и линий ниже.

В нем будут перечислены значения отдельных исходов. Экспортируйте данные в текстовый файл и откройте его в excel. Здесь приведен пример анализа S-сфероидов с MCF 10 A one, нормальными эпителиальными клетками молочной железы, HAS трансформированными MCF 10 A neo T клетками и M two производными MCF 10 CA one A.

Клетки М1 показали лишь слабую инвазию без стимуляции, но значительно лучше инвазировали после стимуляции TGF beta. В противоположность этому, РА преобразовывали производное М1 М1 и эффективно инвазировали без добавления стимулов, и это число было увеличено в четыре-пять раз. После лечения TGF бета клетки М-4 показали самую сильную инвазию как без TGF Beta Edition, так и с ним.

Графическое представление результатов данного эксперимента было получено с помощью фотошопа и показано здесь в данном примере, в клеточные культуры SB 4 31 5 42 был добавлен аналог A TP и селективный ингибитор киназной активности TGF бета-рецептора one, а также активный в рецепторе первого типа B рецептор и активный в рецепторе, подобный киназе 7, был добавлен в клеточные культуры SB 4 31 5 42, мощно ингибированная, индуцированная TGF-бета инвазия в клетки M1, M-2 и M-4, что указывает на то, что индуцированная TGF-бета-инвазия является TGF-бета-рецептором с одной киназой. Кроме того, базальная инвазия ФЭ была сильно подавлена. Графическое представление результатов этого эксперимента было вновь создано с помощью Photoshop и показано здесь.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как выделение РНК или выделение белков, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, какие гены или какие белки экспрессируются. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как найти новые модуляторы индуцированной тавитой инвазии.