Определение целей по правам микроРНК с Пробирной LightSwitch люциферазы системы с помощью 3'UTR-репортер Формирует и микроРНК Mimic в прилипшие клетки

Общая цель данной процедуры заключается в котрансфекции репортерных конструкций с миметиком микроРНК для валидации предсказанных мишеней микроРНК в 3'-UTR человека. Это достигается путем предварительной разработки плана эксперимента, включающего выбор клеточной линии и подбор миметиков микроРНК, а также экспериментальных и контрольных репортерных конструкций GoClone с 3'-UTR. Адгезивные клетки высевают примерно за 24 часа до трансфекции. Следующим этапом процедуры является котрансфекция каждой экспериментальной или контрольной репортерной конструкции GoClone с 3'-UTR с миметиком микроРНК, нецелевым или контрольным миметиком, с последующей инкубацией в течение 24–48 часов. На заключительном этапе реагент для анализа LightSwitch Luciferase добавляют непосредственно к клеткам в культуральную среду, после чего считывают люминесцентный сигнал на планшетном люминометре.

В конечном итоге можно получить результаты, показывающие, какие 3'-UTR человека являются мишенями для данной микроРНК, путем измерения снижения сигнала люциферазы с помощью технологии репортерного анализа. Этот метод может помочь исследователям микроРНК ответить на ключевые вопросы, так как он предоставляет функциональный анализ для валидации предсказанных взаимодействий микроРНК с мишенями в 3'-UTR в живых клетках. Дизайн эксперимента начинается с выбора подходящей адгезивной клеточной линии с высокой эффективностью трансфекции; анализы с использованием миметиков микроРНК работают лучше всего в клеточных линиях с низким уровнем эндогенной экспрессии данной микроРНК.

Затем выберите пару из мимика микроРНК и нецелевого контроля; включение нецелевого контроля крайне важно, так как ко-трансфекция плазмиды и короткого олигонуклеотида РНК приводит к более слабому сигналу, чем трансфекция одной только плазмиды. Далее выберите предклонированные репортерные конструкции GoClone с 3'-UTR из общегеномной коллекции Switchgear. Перейдите в онлайн-каталог и нажмите кнопку поиска UTR.

После ввода списка названий генов, символов генов или номеров доступа в результатах поиска будет представлена информация о векторах и последовательностях, а также статус наличия в инвентаре. Теперь выберите контрольные репортерные конструкции. Выберите контрольные конструкции с 3' UTR, которые вряд ли станут мишенями для выбранной microRNA, например, UTR генов «домашнего хозяйства» или случайные фрагменты, чтобы контролировать неспецифические эффекты гиперэкспрессии microRNA на общее состояние клеток или сигнал анализа.

Также рекомендуется использовать синтетический репортер мишени микроРНК в качестве положительного контроля активности мимика. В первый день посейте адгезивные клетки с низким числом пассажей, чтобы через 24 часа к моменту трансфекции они достигли 80–100% конфлюэнтности. Использование высококонфлюэнтных клеток является ключевым фактором для получения хороших результатов. Посейте клетки в белый 96-луночный планшет для культивирования тканей, используя общий объем 100 µL.

Параллельно проверьте количество клеток в прозрачном планшете на достижение слияния на 2-й день, через 24 часа после посева клеток. Подготовьте реагенты для трансфекции путем размораживания.

Разморозьте репортерные конструкции и микроРНК при комнатной температуре. После размораживания тщательно перемешайте и разведите микроРНК до рабочей концентрации 2 µM в воде, свободной от РНК. Плазмидная ДНК поставляется в концентрации 30 ng/µL и не требует дальнейшего разведения. При подготовке смеси для трансфекции учитывайте, что каждая комбинация ДНК-РНК должна быть трансфицирована в трех повторностях; объем следует масштабировать в соответствии с количеством выполняемых анализов.

Приготовьте смесь реагента для трансфекции, смешав 9,85 µL безсывороточной среды и 0,15 µL Dharma effect DUO на одну трансфекцию. Инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем приготовьте смесь ДНК-РНК для каждого анализа, смешав 3,33 µL репортерной конструкции go clone с количеством мимика микроРНК, необходимым для достижения желаемой конечной концентрации.

Доведите объем до 10 µL с помощью безсывороточной среды. Затем смешайте 10 µL смеси реагента для трансфекции с 10 µL каждой смеси ДНК-РНК и тщательно перемешайте. Конечный объем для каждого анализа составляет 20 µL.

Плотно закройте и инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре. После инкубации добавьте 80 мкл предварительно прогретой среды без антибиотиков. Общий объем полной среды составит 100 мкл на каждую лунку анализа, что обеспечит конечную концентрацию мимиков от 10 до 15 нМ.

В качестве заключительного этапа осторожно удалите среду из каждой лунки с посеянными клетками и замените ее 100 µL соответствующей конечной смеси для трансфекции. Поместите планшет обратно в инкубатор и инкубируйте в течение 24–48 часов. Большинство смесей дадут значимые результаты в течение 24 часов.

Период инкубации в течение 48 часов приведет к более высокой вариабельности сигнала между лунками. На 3-й день, через 24 часа после трансфекции, проведите люциферазный анализ с использованием реагентов для анализа light switch luciferase; клетки можно анализировать сразу или заморозить при -80 °C и проанализировать позже. Добавление цикла замораживания-оттаивания приведет к усилению лизиса клеток и повышению сигнала репортера. Доведите плашку с трансфецированными клетками до комнатной температуры.

Затем приготовьте раствор для анализа люциферазы light switch в соответствии с инструкциями к набору и перелейте его в стерильный резервуар. С помощью многоканального дозатора внесите по 100 µL раствора для анализа light switch непосредственно в каждую лунку белого 96-луночного планшета. Накройте планшет, защитите его от света и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре.

Считывайте каждую лунку в течение двух секунд на планшетном люминометре. Снижение активности репортера люциферазы с 3'-UTR под действием let-7a измеряли в клетках HT-1080 путем котрансфекции каждой репортерной конструкции с миметиком let-7a или нецелевым контролем. При анализе результатов принимайте сигнал от нецелевого контроля за 100% для каждой конструкции.

Рассчитайте процент нокдауна, разделив сигнал от специфического мимика микроРНК на сигнал нецелевого контроля. Любой конкретный мимик микроРНК может оказывать неспецифическое воздействие на общую жизнеспособность клеток или сигнал анализа, что необходимо учитывать для коррекции неспецифических эффектов. Сравните нокдаун, наблюдаемый для экспериментальной мишени UTR, с нокдауном, наблюдаемым для контрольной или случайной мишени T, как показано здесь.

PONC и arid 3B человека являются мишенями микроРНК let-7a. Сигналы от репортеров 3'-UTR человека для генов PONC и arid 3B значительно снижаются в присутствии миметика микроРНК let-7a, в то время как сигналы для репортеров хозяйственных генов и случайных последовательностей UTR остаются неизменными. После просмотра этого видео вы получите четкое представление о том, как правильно провести котрансфекцию миметиков микроРНК и репортерных конструкций 3'-UTR в живых клетках, а также как с помощью люминометра измерить подавление сигнала.