Ортогональные очистки белков Ведущий: Малый Биспецифичные тегов Affinity

Общая цель следующего эксперимента — получение высокочистых рекомбинантных белков с помощью двухэтапной процедуры аффинной очистки. Для этого биспецифический тег очистки на основе альбумин-связывающего домена клонируют в экспрессионный вектор, содержащий ген целевого белка, после чего экспрессируют слитный белок в e coli. На втором этапе бактериальный лизат, содержащий целевой белок, подвергают очистке на хроматографической колонке с иммобилизованным альбумином сыворотки крови человека или HSA.

Затем проводят дополнительную очистку на колонке MAB select superior resistance или sure, содержащей иммобилизованный Z-домен, производный от стафилококкового белка A. В результате получается высокочистый продукт, подходящий для сложных приложений. Далее чистота оценивается с помощью SDS-PAGE и, при необходимости, масс-спектрометрии, чтобы убедиться, что целевой белок был успешно очищен до гомогенного состояния; результаты демонстрируют эффективную очистку после двух последовательных этапов по сравнению с одним этапом с использованием нового биспецифического очищающего тега, примененного в данном протоколе. Основным преимуществом этого метода перед существующими способами, такими как одноэтапная аффинная очистка, является то, что чистый белок может быть получен с помощью простого протокола с использованием только одного аффинного звена независимо от свойств целевого белка.

Данный метод можно использовать для белков с очень разнообразными характеристиками. Кроме того, благодаря малому размеру метки, она легко экспрессируется бактериальным хостом. Как правило, специалисты, впервые применяющие данную процедуру очистки, находят ее очень простой и понятной.

Критически важным этапом является корректировка pH вашего образца перед нанесением его на вторую колонку. Малый очищающий таг с двумя присущими ему сродствами был разработан путем введения дополнительного сайта связывания в существующий альбумин-связывающий домен, производный от белка G стрептококков. Альбумин-связывающий домен из 46 аминокислот сворачивается в стабильный пучок из трех спиралей и содержит сайт связывания для сывороточного альбумина человека, расположенный преимущественно на второй спирали; путем генетической рандомизации 11 поверхностно расположенных аминокислот в первой и третьей спиралях были созданы новые связывающие поверхности. Несколько раундов биопаннинга с использованием Z-домена, производного от белка A стафилококков, при экспрессии комбинаторной библиотеки на фагах, привели к созданию биспецифической молекулы, названной A BDZ one, обладающей сродством как к HSA, так и к Z-домену. Для подготовки плазмиды экспрессии биспецифического слитого тага подготовьте PCR-фрагменты гена A BDZ one, фланкированные подходящими сайтами рестрикции для лигирования и терминального слияния с целевым геном в экспрессионной плазмиде. Расщепите PCR-фрагменты A BDZ one и очищенный экспрессионный вектор, содержащий интересующий ген, с помощью выбранных рестрикционных ферментов в подходящем реакционном буфере; очистите продукты перед лигированием.

Затем лигируйте один рестрикционный фрагмент A BDZ в экспрессионный вектор, содержащий исследуемый ген, и трансформируйте продукт лигирования в e coli. Высейте трансформированные клетки на чашки с агаром, дополненным подходящими антибиотиками для селекции. Проведите ПЦР-скрининг нескольких колоний и подтвердите последовательность полученной экспрессионной кассеты с помощью секвенирования ДНК.

Наконец, подготовьте плазмиду из ночной культуры колонии с подтвержденной последовательностью и трансформируйте её в предпочтительный экспрессионный штамм для экспрессии целевого белка с новым тегом, присоединенным к его концу. Сначала инокулируйте одну бактериальную колонию в 10 миллилитров триптиказ-соевого бульона, дополненного пятью граммами на литр дрожжевого экстракта и соответствующими антибиотиками; инкубируйте при 150 об/мин и 37 °C в течение ночи. На следующий день инокулируйте один миллилитр ночной культуры в 100 миллилитров свежей среды и индуцируйте экспрессию белка.

Когда клетки достигают логарифмической фазы роста. После индукции белка инкубируйте клетки при 150 об/мин и 25 °C в течение ночи, на следующий день соберите клетки путем центрифугирования. Ортогональная аффинная очистка слитого белка A BDZ one достигается путем первоначальной очистки либо на колонке с иммобилизованным HSA, либо на zoma. Затем проводится последующий этап очистки с использованием второго аффинного сайта биспецифической метки.

Для очистки антител доступны хроматографические среды с иммобилизованным Z-доменом, такие как MA select sure. В то же время HSA может быть химически присоединен к среде для создания второй матрицы с целью проведения ортогональной аффинной очистки. Ресуспендируйте осадок в 25 миллилитрах рабочего буфера. Затем разрушьте клетки с помощью соникации при амплитуде 60% импульсами по одной секунде с последующей паузой в одну секунду в течение трех минут в общей сложности.

После центрифугирования образца профильтруйте супернатант, содержащий целевой белок, через фильтр с порами 0,45 мкм перед дальнейшей очисткой. Затем уравновешивают колонку HSA spheros объемом 1 мл или NHS-активированную колонку, связанную с HSA, 10 объемами колонки рабочего буфера со скоростью потока 1 мл/мин на подходящей системе очистки белков. После уравновешивания нанесите бактериальный лизат со скоростью 0,5 мл/мин, верните скорость потока к 1 мл/мин и промойте колонку пятью объемами колонки рабочего буфера, затем пятью объемами колонки промывочного буфера.

Элюируйте образец элюирующим буфером со скоростью 1 мл/мин и соберите фракции. Контролируйте поглощение при 280 нм для отбора фракций из элюированного пика. Для дальнейшей очистки объедините фракции с наибольшей концентрацией белка, затем разведите их в два раза.

Подготовьте бегущий буфер и убедитесь, что его pH близок к нейтральному. Этот этап имеет решающее значение для связывания белка с Z-доменом. При необходимости добавьте 1 M Tris-HCl (pH 8) для повышения значения pH.

Затем нанесите образец со скоростью 0,5 мл в минуту на колонку-ловушку SureTrap MA объемом 1 мл, предварительно уравновешенную рабочим буфером Sure. После того как скорость потока будет установлена на 1 мл в минуту, промойте колонку пятью колоночными объемами рабочего буфера Sure. Затем элюируйте белки с помощью 0,2 М уксусной кислоты при pH 2,7 для чувствительных целевых белков.

EIT можно нейтрализовать непосредственно при сборе путем добавления T tris. Для оценки чистоты белка можно использовать SDS-PAGE. Важно полностью восстановить образец, так как свободный цистеин в A BDZ one может вызвать димеризацию продукта в неокисляющих условиях.

В качестве заключительного этапа молекулярную массу очищенного продукта можно проанализировать методом масс-спектрометрии после очистки с помощью ортогонального протокола на колонке HSA с последующим использованием колонки MA select sure. Образцы, отобранные на нескольких этапах очистки, были проанализированы с помощью SDS-PAGE. Образцы включали сам тег A BDZ one, а также три различных человеческих целевых белка, слитые с AB DZ one, которые представляют разные классы растворимости, молекулярные массы и изоэлектрические точки.

Дорожки с первой по четвертую демонстрируют лизаты белков перед очисткой для трех различных слитых белков AB DZ one и самого тега AB DZ one. Дорожки с пятой по восьмую показывают результаты этапа очистки белков с помощью HSA. Наконец, дорожки с девятой по 12-ю представляют результат заключительного этапа очистки с использованием mAbs select Sure.

Кроме того, здесь были проанализированы образцы, полученные из тех же лизатов, очищенных в обратном порядке на тех же колонках. Дорожки с первой по третью представляют лизаты до очистки, в то время как дорожки с четвертой по шестую были получены после первого этапа очистки на колонке MAB Select Sure. Продукты высокой чистоты на дорожках с седьмой по девятую являются результатом окончательной очистки HSA.

Результаты наглядно демонстрируют эффективность использования двойного тега и двух высокоспецифичных этапов очистки. Несмотря на то что, судя по гелям, после первого этапа очистки достигается приемлемая степень чистоты, последующий этап позволяет получить очень чистый продукт, который хорошо подходит для применения в самых требовательных задачах. После освоения основного этапа очистки данного метода один человек может за несколько часов получить высокоочищенный рекомбинантный белок, подходящий для множества различных приложений.

Например, после выполнения данной процедуры очищенные биомолекулы можно использовать для других целей, таких как изучение взаимодействий для определения таких параметров, как сила связывания комплекса. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как получить действительно чистый белковый продукт, используя этот двойной аффинный тег.