Твердофазные Submonomer Синтез Peptoid полимеров и их самосборки в Высоко-упорядоченные нанолистов

Общая цель данной процедуры — описать простой и эффективный метод твердофазного синтеза пептидов и их последующей водной самосборки в высокоупорядоченные нанолисты. Пептиды, структурно схожие с полипептидами, представляют собой замещенные полимеры глицина, в которых боковые цепи присоединены к азоту, а не к альфа-углероду. Процесс начинается с синтеза конкретной пептидной последовательности с помощью метода других субмономеров.

Метод субмономерного синтеза состоит из двух простых химических стадий, которые позволяют последовательно вводить каждый мономер в цепь. Сначала амин, прикрепленный к твердому носителю, подвергается бром-ацетилированию. Затем бромид замещается первичным амином.

Эти стадии повторяют до достижения желаемой длины цепи. После удлинения цепи пептид отделяют от твердого носителя, а полученное сырое пептидное масло очищают методом ВЭЖХ и характеризуют для инициирования самосборки пептидов в нанолисты. В стеклянном флаконе готовят разбавленный водный буферный раствор пептида и осторожно перемешивают. В качестве заключительного этапа.

Нанолисты исследуются под микроскопом. Результаты демонстрируют, что итерационный цикл из двух простых химических стадий может привести к получению полимера со специфической последовательностью, который спонтанно самоорганизуется в нанолисты. Пептиды представляют собой новый класс биомиметических полимеров, свойства которых занимают промежуточное положение между белками и традиционными полимерами.

Пептиды обладают прочностью и синтетической универсальностью, характерными для традиционных полимеров, но при этом они, подобно белкам и ДНК, обладают высокой способностью к настройке и последовательной специфичностью. Пептиды становятся перспективным материалом для решения ключевых проблем биомедицины и материаловедения, таких как идентификация биоактивных лекарственных средств или дизайн искусственных белков. Основными преимуществами пептидов являются точный контроль последовательности, доступность невероятно разнообразных структурных блоков, эффективность синтеза и стабильность к действию протеаз. Описан общий метод ручного синтеза пептидов с использованием базового оборудования и коммерчески доступных реагентов, что позволяет легко синтезировать пептиды в большинстве лабораторий.

Визуальная демонстрация этапов синтеза имеет критическое значение и служит ценным руководством для специалистов, начинающих работу в области твердофазного синтеза. Впервые здесь описываются очистка и характеристика амфифильного пептида из 36 меров, а также его самосборка в высокоупорядоченные нанолисты. Начните выполнение данного протокола с настройки экспериментальной установки, как описано в письменном руководстве.

Для наглядности следующие действия будут выполняться в стекком реакционном сосуде вместо одноразового полипропиленового картриджа с фриттованным фильтром. После помещения 100 mg смолы R-amide в реакционный сосуд с фриттованным фильтром набухают смолу, добавив 2 mL диметилформамида (DMF), и перемешивают путем барботирования в течение 10 минут. Затем раствор сливают с помощью вакуума, чтобы изолировать набухшую смолу.

Затем добавьте один миллилитр 20% раствора N-метилпиридина в DMF для снятия защиты с FM O-группы. Перемешивайте в течение двух минут, после чего слейте раствор. Повторяйте эту процедуру в течение 12 минут, затем промойте смолу, добавив два миллилитра DMF, перемешав в течение 15 секунд и слив жидкость.

Начните наращивание пептидной цепи с первого цикла синтеза субмономера, который включает стадию бромацетилирования и стадию замещения. Для бромацетилирования добавьте 1 мл 0,6 М бромуксусной кислоты в DMF и 86 µL диизопропилкарбаmidiда. После перемешивания в течение 30 минут слейте раствор и промойте систему двумя миллилитрами DMF.

Затем проведите вытеснение, добавив 1 мл 1–2 М амина в N-метилпирролидоне; инкубируйте от 30 до 120 минут. После инкубации слейте жидкость и промойте 2 мл DMF. Далее продолжите наращивание пептидной цепи, повторяя цикл добавления мономера. После завершения последнего этапа вытеснения промойте 2 мл DMF.

После этого закройте сосуд колпачком для промывки метаном diora и храните реакционный сосуд до момента расщепления. Чтобы начать расщепление, перенесите всю высушенную смолу в сцинтилляционный стеклянный флакон объемом 20 milliliter; работая внутри вытяжного шкафа и используя соответствующие средства индивидуальной защиты, добавьте в сцинтилляционный стеклянный флакон четыре milliliters трифторуксусной кислоты или коктейля для расщепления TFA и закройте крышкой. Интенсивно перемешивайте от 10 минут до двух часов при комнатной температуре.

В качестве альтернативы для перемешивания раствора можно использовать ротационный шейкер. Соберите раствор после расщепления TFA, отфильтровав смолу через одноразовый полипропиленовый фильтрующий картридж в новую предварительно взвешенную сцинтилляционную стеклянную виалу объемом 20 миллилитров. Затем добавьте один миллилитр свежего коктейля для расщепления, чтобы промыть смолу и собрать остатки пептида.

Повторите эту процедуру, промойте дважды. Удалите TFA, обдувая осторожным потоком азота или используя био-заряд. В испарителе V 10 растворите неочищенное масло в шести миллилитрах смеси ацетонитрила и воды в соотношении один к одному.

Затем заморозьте и лиофилизируйте образец. Эту процедуру следует повторить еще раз после второй лиофилизации. Запишите массу сырого продукта, который следует хранить в виде сухого порошка при температуре минус 20 °C, и проанализируйте его с помощью аналитической ВЭЖХ и/или жидкостной хромато-масс-спектрометрии с электрораспылением (LCMS).

Чистоту неочищенного продукта и наличие желаемой молекулярной массы можно определить, следуя процедурам, изложенным в тексте. Затем смесь неочищенных пептидов можно очистить с помощью препаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ согласно описанному методу. В данном разделе описывается протокол формирования листов из амфифильного 36-членного пептида с одноцепочечной специфической последовательностью.

После синтеза, очистки и лиофилизации пептидной цепи полученный белый порошок растворяют в DMSO для приготовления стокового раствора с концентрацией 2 мМ. Затем, используя файл Dr.Glass, готовят пептидный раствор с концентрацией 20 мкМ. Для этого сначала добавляют 445 мкл воды Milli-Q и 50 мкЛ 10-кратного буфера для формирования листов.

Перемешайте содержимое пробирки на вортексе. Затем добавьте 5 µL стокового раствора пептида с концентрацией 2 mM и осторожно перемешайте до набухания. Полученные листы раствора формируются путем осторожного перемешивания разбавленного водного раствора пептида.

Медленный наклон закрытой стеклянной виалы из горизонтального положения в вертикальное. Это приводит к осторожному встряхиванию листов, что также позволяет получить листы. Однако такие листы, как правило, оказываются меньше и имеют меньше прямых краев, чем многие высококачественные листы.

Медленно вращайте стеклянные флаконы вокруг горизонтальной оси в течение одного дня, используя ротатор для пробирок или специально сконструированную качалку, для флуоресцентного окрашивания нанолистов; добавьте 1 µL 100 µM Nile red к 100 µL раствора нанолистов, чтобы получить конечную концентрацию 1 µM Nile red. Nile red представляет собой чувствительный к окружающей среде краситель, интенсивность флуоресценции которого возрастает при локализации в гидрофобных средах. Затем приготовьте 1% раствор агарозы в горячей воде и разлейте его в пластическую чашку Петри.

Убедитесь, что слой раствора агарозы имеет толщину примерно одну восьмую дюйма, и дайте раствору остыть в неподвижном состоянии на плоской поверхности. После застывания агарозы с помощью шпателя вырежьте квадраты размером один сантиметр на один сантиметр. Затем перенесите вырезанные квадраты на предметное стекло, чтобы собрать пластинки в одной плоскости; нанесите один микролит раствора образца на фрагмент агарозы.

Через две минуты aros должен абсорбировать буфер, в результате чего листы останутся на поверхности. Проведите визуализацию листа в течение 15 минут. В качестве альтернативного варианта для визуализации листов и раствора внесите 15 µL внутрь прокладки диаметром 20 мм и толщиной 0,12 мм на предметном стекле.

Накройте образец покровным стеклом и проведите съемку в течение нескольких дней для выполнения СЭМ нанолистов. Сначала подвергните кремниевые чипы плазменному травлению, чтобы облегчить адсорбцию нанолистов. Затем нанесите 20 µL раствора пептидных листов на обработанную плазмой кремниевую подложку и оставьте раствор на три минуты; удалите излишки раствора кончиком салфетки Kimwipe, нанесите 20 µL воды на поверхность и снова удалите излишки раствора, чтобы избавиться от буфера и солей.

В качестве альтернативы растворы пептидных листов подвергают диализу против воды для удаления буфера и соли. В этом случае 20 µL диализованного раствора листа можно нанести каплями на подложки из кремния, обработанные плазмой, и оставить высыхать на воздухе. После высыхания раствора листа на подложках из кремния, обработанных плазмой, лист можно визуализировать с помощью SEM, используя внутрилинзовый детектор при энергии пучка от 1 kV до 5 kV.

Был проведен синтез, характеристика и очистка специфической последовательности 36-членного пептида с блочным зарядом, который сворачивается в высокоупорядоченный двухмерный нанолист. При синтезе 36-членного пептида с блочным зарядом использовались амины: этилендиамин, фенэтиламин и т-бутил-бета-аланин. После синтеза неочищенный пептид был отделен от смолы с помощью 95% водного TFA.

После сбора и упаривания раствора TFA неочищенный блок-заряженный пептид 36 me очищали с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ. Затем массу очищенного блок-заряженного пептида подтверждали методом масс-спектрометрии.

Наблюдаемая масса 4981.2 близка к расчетной массе 4981.74. Лиофилизированный порошок растворяли в DMSO для приготовления стокового раствора с концентрацией 2 мМ и хранили при температуре 4 °C. Срезы готовили согласно вышеописанному протоколу и визуализировали с помощью флуоресцентной оптической микроскопии.

Наблюдаются разнообразные формы с размерами элементов до 300 микрон, при этом особенно заметны прямые края. СЭМ также использовался для получения изображений листов, которые аналогичным образом выявили выраженные прямые края. В данном видео описывается простой и эффективный протокол твердофазного синтеза пептидов и их последующей самосборки в водной среде с образованием нанолистов.

Поскольку буквально сотни аминокислотных строительных блоков легко доступны и могут быть использованы в данном протоколе, пространство дизайна, доступное с помощью полипептидов, практически безгранично. Пептиды являются перспективными материалами для биомедицинских исследований и нанонауки благодаря их синтетической гибкости, стабильности и упорядоченности. В частности, на атомном уровне нанолисты служат потенциальной платформой для создания двумерных дисплейных каркасов, миметиков мембран, биологических сенсоров, миметиков белков и изготовления устройств.

Работа с коррозионными реагентами, такими как триор, уксусная кислота и бромуксусная кислота, чрезвычайно опасна; чтобы избежать травм, проводите все реакции в вытяжном шкафу и используйте соответствующие средства индивидуальной защиты.