Твердофазные Submonomer Синтез Peptoid полимеров и их самосборки в Высоко-упорядоченные нанолистов

Общая цель данной процедуры состоит в том, чтобы описать простой и эффективный метод синтеза твердофазных пептидов и водной самосборки пептидов в высокоупорядоченные нанолисты. Структурно похожие на полипептиды, пептиды находятся в замещенных полимерах глицина, где боковые цепи присоединены к азоту, а не к альфа-углероду. Процесс начинается с синтеза определенной пептидной последовательности с помощью другого субмономерного метода.

Метод субмономера состоит из двух простых химических стадий, на которых каждый мономер последовательно вводится в цепь. Сначала амин, прикрепленный к твердой основе, бромацетилируется. Во-вторых, бромид вытесняется первичным амином.

Эти шаги повторяются до тех пор, пока не будет достигнута желаемая длина цепи. После удлинения цепи пептид отделяют от твердой основы, и полученное сырое пептидное масло очищают с помощью ВЭЖХ и характеризуют для инициирования самосборки пептидов в нанолисты. Разбавленный водный буферный раствор пептида готовят в стеклянном флаконе и аккуратно перемешивают. В качестве заключительного шага.

Нанолисты исследуются под микроскопом. Результаты показывают, что итеративный цикл из двух простых химических этапов может привести к образованию полимера, специфичного для последовательности, который спонтанно самособирается в нанолисты. Пептиды представляют собой новый класс биоинспирированных полимеров со свойствами между свойствами белков и традиционных полимеров.

Они прочны и синтетически универсальны, как традиционные полимеры, но также обладают высокой способностью к настройке и специфичными к последовательностям, как белки и пептиды ДНК, становятся передовым материалом для решения ключевых проблем биомедицины и материаловедения, таких как идентификация биологически активных лекарств или разработка искусственных белков. К основным преимуществам пептидов относятся точный контроль последовательности, наличие невероятно разнообразных строительных блоков, эффективный синтез и стабильность протеазы. Описан общий метод ручного синтеза пептидов с использованием базового оборудования и коммерчески доступных реагентов, позволяющий легко синтезировать пептиды в большинстве лабораторий.

Визуальная демонстрация этапов синтеза имеет решающее значение и служит ценным справочным материалом для людей, начинающих заниматься твердофазным синтезом. Здесь впервые описана очистка и характеризация амфифильного пептида 36 мерс, а также его самосборка в высокоупорядоченные нанолисты. Начните этот протокол с настройки экспериментального аппарата, как описано в письменном протоколе.

Следующие шаги будут выполнены в стеклянном реакционном сосуде вместо одноразового картриджа с полипропиленовыми фриттами для прозрачности. После установки на 100 мг Rамидной смолы в фриттированный реакционный сосуд набухают смолу, добавляя два миллилитра диметилформы амида или перемешивают ДМФУ путем барботирования в течение 10 минут. Затем слейте раствор с помощью вакуума, чтобы изолировать набухшую смолу.

Затем добавьте один миллилитр 20% полного метилпиридина в ДМФА для защиты группы FM O. Помешайте в течение двух минут и процедите. Повторяйте этот процесс в течение 12 минут, затем промойте смолу, добавив два миллилитра DMF, перемешивая в течение 15 секунд и сливая воду.

Начните выращивание пептидной цепи с первого субмономерного цикла, который включает в себя бромацетилирование и стадию вытеснения. Для бромоацетилирования добавьте один миллилитр 0,6 моляра бромуксусной кислоты в ДМФА и 86 микролитров диизопропилкарбоклеща. После перемешивания в течение 30 минут слейте воду и промойте двумя миллилитрами ДМФА.

Затем выполните вытеснение, добавив один миллилитр одного-двух молярных аминов в конечный метилпирогенон, инкубируйте в течение 30-120 минут после инкубации, слейте воду и промойте двумя миллилитрами ДМФА. Опять же, продолжайте наращивать пептидную цепь, повторяя субмономерный цикл. После того, как окончательное вытеснение будет сделано, промойте двумя миллилитрами ДМФ.

После этого наденьте на диорный промывочный колпачок метана и храните реакционный сосуд до расщепления. Чтобы начать расщепление, перелейте всю высушенную смолу в флакон из сцинтилляционного стекла объемом 20 миллилитров, работающий внутри вытяжки, и, используя надлежащие средства индивидуальной защиты, добавьте четыре миллилитра трифторуксусной кислоты или коктейля для расщепления TFA во флакон и крышку из сцинтилляционного стекла. Плотно перемешайте от 10 минут до двух часов комнатной температуры.

В качестве альтернативы используйте вращающийся шейкер для смешивания раствора. Соберите раствор для расщепления TFA, отфильтровав смолу через одноразовый картридж с фриттами из полипропилена в новый предварительно взвешенный флакон из сцинтилляционного стекла объемом 20 миллилитров. Далее добавьте один миллилитр свежего коктейля для расщепления, чтобы промыть смолу и собрать остатки пептида.

Повторите это, прополощите дважды. Испаряйте TFA с помощью слабой струи азота или с помощью заряда био. Испаритель V 10 красного цвета растворяет сырую нефть в шести миллилитрах один к одному ацетонитрилу и воде.

Затем заморозьте и лиофилизируйте образец. Этот процесс следует повторить еще раз после второй лиофилизации. Запишите вес сырого продукта в виде сухого порошка при температуре минус 20 градусов Цельсия с помощью комбинации заплесневелой аналитической ВЭЖХ и/или электрораспылителя LCMS.

Чистота сырого продукта и наличие желаемой молекулярной массы могут быть определены путем выполнения процедур, изложенных в тексте. Затем смесь сырых пептидов может быть очищена с помощью ВЭЖХ с обратной фазой в соответствии с описанной методикой. В этом разделе описан протокол формирования листов из одноцепочечной последовательности специфического амфифильного пептида 36 ME.

После того, как пептидная цепь синтезирована, очищена и лиофилизирована, полученный белый порошок растворяют в ДМСО с получением двухмиллимолярного стокового раствора. Далее приобретаем один файл Dr.Glass для приготовления раствора пептида 20 микромоляров. Сначала добавьте 445 микролитров воды milli Q и 50 микролитров 10 x буфера для формования листа.

Вортексом пробирку перемешать. Затем добавьте пять микролитров двухмиллимолярного пептидного стокового раствора и аккуратно набухните. Полученные листы раствора формируют путем осторожного перемешивания разбавленного водного пептидного раствора.

Медленно наклоняем закрытый стеклянный флакон из горизонтального положения в вертикальное. Приводит к легкому встряхиванию листов, также дает листы. Тем не менее, листы, как правило, меньше по размеру и с меньшим количеством прямых краев для многих высококачественных листов.

Медленно вращайте стеклянные флаконы вокруг горизонтальной оси в течение одного дня с помощью вращателя трубки или специальной качалки для флуоресцентного окрашивания нанолистов, добавьте один микролитр 100 микролярного нильского красного на 100 микролитров нанолистового раствора, чтобы получить конечную концентрацию одного микромолярного нильского цвета. Красный цвет является экологически чувствительным красителем, интенсивность флуоресценции которого увеличивается при его локализации в гидрофобных средах. Далее сделайте 1%-ный раствор в горячей воде и вылейте в пластиковую чашку Петри.

Убедитесь, что толщина раствора aros составляет примерно одну восьмую дюйма, и дайте раствору спокойно остыть на ровной поверхности. После того, как арос застынет, с помощью шпателя разрежьте квадраты размером один сантиметр на один сантиметр. Затем переложите вырезанные квадраты на предметное стекло, чтобы собрать листы в одну плоскость пятна по одному микролитру листового раствора на кусок арос.

Через две минуты арос должен впитать буфер, оставив листы на поверхности. Сфотографируйте лист в течение 15 минут. Как вариант, для изображения листов и раствора загрузите 15 микролитров внутрь 20-миллиметровой прокладки диаметром 0,12 миллиметра на предметное стекло

Накройте образец покровным листом и изображением в течение нескольких дней для выполнения РЭМ нанолистов. Во-первых, плазменное травление кремниевых чипов для помощи в поглощении нанолистов. Затем капните 20 микролитров пептидного листового раствора на обработанную плазмой кремниевую подложку и дайте раствору отстояться через три минуты, удалите излишки раствора с помощью кончика пипетки Кима, вытрите 20 микролитров воды на поверхность и снова отведите лишний раствор, чтобы удалить буфер и соли.

В качестве альтернативы, растворы пептидных листов диализуются против воды для удаления буфера и соли. В этом случае 20 микролитров диализованного листового раствора можно капнуть на обработанные плазмой силиконовые подложки и дать им высохнуть на воздухе. После того, как листовой раствор высохнет на обработанных плазмой кремниевых подложках, лист может быть визуализирован с помощью РЭМ с использованием детектора в линзе при энергиях пучка от одного киловольта до пяти киловольт.

Был проведен синтез, характеризация и очистка последовательно-специфичного пептида блок-заряда размером 36 me, который сворачивается в высокоупорядоченный двумерный нанолист. Амины, использующие синтез пептида с блок-зарядом 36 me, превращают этилендиамин в фенэтил, амин и t-бутилбета-аланин. После синтеза сырой пептид отделяли от смолы с 95% водными ТФК.

После ТЖК раствор собирался и выпаривался. Исходный пептид 36 ме блочного заряда был очищен с помощью ВЭЖХ в обратной фазе. Масса очищенного пептида блочного заряда затем подтверждалась методом плесени.

Наблюдаемая масса 4981,2 близко совпадает с расчетной массой 4981,74. Лиофилизированный порошок растворяли в ДМСО с получением двухмиллимолярного исходного раствора и хранили при четырех градусах Цельсия. Листы были подготовлены по вышеуказанному протоколу и изображены с помощью флуоресцентной оптической микроскопии.

Наблюдаются различные формы с размерами элементов до 300 микрон, в частности, выделяются прямые края. SEM также использовался для изображения листов, аналогичным образом обнажая выступающие прямые края. В этом видео описывается простой и эффективный протокол синтеза пептидов на твердом лице и водной самосборки пептидов в нанолисты.

Поскольку буквально сотни строительных блоков легко доступны и могут быть использованы в этом протоколе, пространство для проектирования, доступное с полипептидами, практически безгранично. Пептиды являются многообещающими материалами для биомедицинских и нанонаучных исследований из-за их синтетической гибкости, прочности и упорядоченности. В частности, на атомном уровне нанолисты служат потенциальной платформой для двумерных дисплейных каркасов, мембранных миметиков, биологических сенсоров, белковых миметиков и изготовления устройств.

Работа с коррозионными реагентами, такими как триор, уксусная кислота и бромоуксусная кислота, чрезвычайно опасна для предотвращения травм, выполнения всех реакций в вытяжном шкафу и ношения надлежащих средств индивидуальной защиты.