Электропорации черепно-лицевых Мезенхима

Общая цель этой процедуры заключается в электроуправлении заряженными макромолекулами в черепную лицевую мезенхиму. Это достигается путем предварительного помещения обезболенного эмбриона стадии 28 в камеру электропорации. Следующим шагом является микроинъекция раствора, содержащего заряженные макромолекулы, в черепно-лицевую мезенхиму C.

За этим быстро следует подача электрического тока, тем самым вводя заряд нуклеотидов в клетки других клеток. Заключительным этапом процедуры является визуализация электропорированной ткани с помощью флуоресцентной микроскопии. В конечном итоге можно получить результаты, показывающие изменения в черепных тканях лица.

Эти результаты могут быть проанализированы in vivo или в неподвижных тканях с помощью флуоресценции, микроскопии или иммуногистохимии. Основным преимуществом электропорации перед существующими методами, такими как микроинъекция и мутация, является тканевый и временной контроль над нашими молекулярными инструментами, и сегодня нашу процедуру продемонстрирует Джеки Таблер, постдок в моей лаборатории. Пара L-образных электродов, необходимых для этой процедуры, изготавливается из вольфрана высокой чистоты, 0,4 миллиметра вольфрана, для каждого электрода сначала срезается восемь сантиметров проволоки.

Затем с помощью замазки, такой как синяя замазка, воздействуют на одномиллилитровый шприц в средней точке вольфрамовой проволоки, оставляя четыре сантиметра проволоки обнаженными от кончика шприца. Согните кончик в форме буквы L в одном сантиметре от конца. Обрежьте кончик так, чтобы конец был 0,5 сантиметра в длину.

Этот наконечник является концом электрода, по которому проходит лишняя вольфрамовая проволока параллельно шприцу. Он будет использоваться для подключения электродного генератора импульсов после того, как будет изготовлен второй электрод. Крепим пару электродов друг к другу с помощью скотча так, чтобы электродную клемму я проводил параллельно, на расстоянии одного сантиметра друг от друга.

Наконец, подключите электроды к генератору прямоугольных импульсов с помощью кабелей постоянного тока. Чтобы подготовить изготовленную на заказ камеру для электропорации, выстелите дно 90-миллиметровой посуды примерно пятью миллиметрами нетоксичной гипсовой глины для лепки сцены. Наполните чашку электропорационным материалом, погружая гипсовую сцену.

Затем с помощью пинцеров часовщика номер пять вырезать Т-образный колодец в гипсовой сцене, чтобы сформировать электропорацию. Длинная сторона колодца должна иметь размеры примерно два миллиметра на два миллиметра на 10 миллиметров, а короткая сторона должна быть два миллиметра на два миллиметра на пять миллиметров. Микропипетки для этой процедуры изготавливаются из капилляров из силикатного стекла.

Используйте игольчатый съемник для подготовки микропипеток с конусом длиной от восьми до 12 миллиметров и тонким кончиком, сожмите кончик примерно в двух миллиметрах от кончика с помощью щипцов, создавая зубчатый разрыв для установки микропипетки. Во-первых, заполните его примерно одним микролитром раствора для инъекций, который в этой демонстрации содержит флуоресцентно меченные олигонуклеотиды. Далее закрепите микропипетку в микроманипуляторе под углом 50 градусов от столешницы.

Установите давление впрыска на уровне 20 фунтов на квадратный дюйм и откалибруйте микропипетку для подачи 30 литров на импульс. При подготовке к электропорации обезболите личинок ксеновируса 28 стадии, инкубировав их в течение пяти минут. В электропориционных средах, которые являются обычными средами амфибий, содержащими 0,1% бензокаина, обезболенные головастики переносят в камеру электропорации.

Он заполняется средой для электропорации. Самая сложная часть процедуры — это введение микропитомца в головастика. Таким образом, чтобы обеспечить успех, вы должны очень плотно закрепить эмбрион, а затем быстро подать ток после микроинъекции.

Поместите эмбрион в длинную лунку так, чтобы голова покоилась в Т-образном соединении. С опущенной спинной стороной вниз и обнаженной брюшной стороной, голову следует немного приподнять по сравнению с хвостом с помощью щипцов, аккуратно закрепить головастика в колодце с окружающей гипсовой сценой. Важно закрепить головастика, чтобы предотвратить его подергивание во время электропорации, что может привести к серьезному повреждению тканей лица.

Чтобы начать эту процедуру, вставьте наконечник микропипетки непосредственно позади цементной железы и в лицевую механику. Введите 30 нанолитров раствора в мезенхиму, втяните микропипетку. Быстро выровняйте кончики электродов параллельно головке эмбриона и подайте восемь импульсов по 50 миллисекунд 20 милливольт квадратного напряжения.

Затем втяните электроды с помощью щипцов. Осторожно выпустите головастика из колодца. Затем с помощью пипетки перевести головастика на три четверти нома с 0,025 миллиграмма на миллилитр.

Головастиков гентамицина можно инкубировать в этой среде в течение ночи или дольше через 24 часа. Экранируйте головастиков с помощью флуоресцентной микроскопии для эффективной электропорации. Использование флуоресцентных молекул позволяет легко проводить скрининг эмбрионов, подвергнутых электропоре

На этом рисунке показана типичная партия головастиков с электропорацией морф-олигонуклеотидов примерно через 1248 и 96 часов после электропорации. На этапах 30, 34 и 44 соответственно. Флуоресцентные морфо-олигонуклеотиды могут быть визуализированы в черепно-лицевой области на стадиях 30 и 34.

На 44 стадии флуоресцентный свет может быть обнаружен в хрящах, обозначенных белыми стрелками. Высокоаутофлуоресцентной областью является кишечник. Следуя этой процедуре, мы можем отслеживать происхождение электроэлементов, а также молекулярные потребности в белках, представляющих интерес.

Этот подход может быть объединен с методами визуализации в реальном времени для изучения функции генов с течением времени во время черепно-лицевого развития.