Простой метод для работы с изображениями Arabidopsis Листья Использование Perfluorodecalin как инфильтративный Средний изображений

Общая цель данной процедуры заключается в минимизации деградации биологических изображений, вызванной наличием воздушных пространств в листьях растений, для получения более четких изображений живых клеток внутри листа. Если лист закреплен в водной среде и флуорофор возбуждается лазером, многочисленные незаполненные воздушные пространства и изменения показателя преломления внутри ткани (показаны оранжевым цветом) ограничивают интенсивность сигнала, идущего из глубоких слоев ткани, на итоговом изображении. Если же лист закреплен в перфтордекалине (PFD), лазерное возбуждение флуорофора затухает меньше, что обеспечивает лучшую передачу излучаемых сигналов.

В конечном итоге, использование сканирующей лазерной конфокальной микроскопии с иммерсионной средой PFD позволяет получать четкие изображения живых клеток внутри листа растения на глубине, более чем в два раза превышающей ту, которая достижима при использовании водных сред. Основное преимущество данного метода перед существующими подходами, такими как фиксация, монтирование листьев или использование водных сред, заключается в том, что он снижает рефракцию в мезофилле и обеспечивает более точную визуализацию живых клеток в глубоких слоях листа, что ранее представляло проблему. Этот метод может помочь в решении ключевых вопросов биологии растений, таких как изучение биологии клеток мезофилла и сигналинга in vivo, колонизация листьев патогенами и взаимодействие патогенов с тканями, предоставляя тем самым ценные сведения о фундаментальной биологии растений.

Данный метод также может быть применен к другим тканям с высоким коэффициентом преломления и большим количеством воздушного пространства, таким как улитки внутреннего уха или легкие позвоночных. Эту процедуру продемонстрирует доктор Джордж Литтльджон из моей лаборатории. Подготовка образцов в PFD начинается с изготовления предметного стекла с газопроницаемой прокладкой из полидиметилсилоксана или P-D-M-S; P-D-M-S представляет собой вязкоупругий полимер, которому можно придать форму для создания камеры, соответствующей требованиям эксперимента.

Доведите PFD до равновесия с воздухом, встряхнув небольшой объем PFD в наполненном воздухом флаконе. Это также можно сделать путем продувки PFD воздухом; затем перелейте PFD в открытую чашку Петри и поместите целый проросток или вырезанный лист на поверхность жидкости на пять минут. Ткань должна стать полупрозрачной, напоминая витрифицированную ткань.

Листья могут выглядеть темнее или светлее, чем до воздействия PFD, в зависимости от условий освещения и возраста используемой ткани. Наконец, заполните камеру из PDMS аэрированным PFD и осторожно перенесите образцы тканей из чашки Петри для инкубации в камеру из PDMS. Закройте предметное стекло покровным стеклом и выполните съемку.

Согласно требованиям эксперимента, листья месячного возраста инкубировали в течение пяти минут в суспензии рекомбинантного зеленого флуоресцентного белка (GFP). При микроскопическом исследовании образцов листьев, инкубированных в PFD, видно, что большинство воздушных пространств заполнено рекомбинантным GFP, суспендированным в PFD. GFP окрашен в зеленый цвет, красный цвет соответствует хлорофиллу, автофлуоресценции и клеткам мезофилла.

Очевидно, что при инкубации с PFD лист полностью погружается в жидкость, хотя могут оставаться отдельные пузырьки воздуха. В таких условиях вода не обеспечивает полного погружения листа. В данном случае листья opsys, экспрессирующие Venus (вариант YFP, локализующийся в цитозоле), инкубируют и монтируют в воздухе, воде или PFD для лазерного сканирования. Конфокальная микроскопия образцов демонстрирует преимущество PFD перед воздухом и водой, при этом глубина визуализации увеличивается примерно в два раза.

При сравнении PFD и воды; после освоения эта техника может быть выполнена за пять-десять минут при правильном подходе. При выполнении данной процедуры важно помнить, что перифтордекалин растворяет лак для ногтей и тефлон, но совместим с силиконовой смазкой. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как использовать перифтордекалин в качестве иммерсионной среды для улучшения визуализации клеток листьев растений.

Не забывайте, что, хотя перфтордекалин нетоксичен, при выполнении данной процедуры мы рекомендуем соблюдать стандартные правила техники безопасности.