Простой метод для работы с изображениями Arabidopsis Листья Использование Perfluorodecalin как инфильтративный Средний изображений

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы свести к минимуму деградацию биологических изображений, вызванную воздушными пространствами в листьях растений, чтобы получить более четкие изображения живых клеток внутри листа. Если лист установлен в водной монтажной среде и флуорофор возбуждается лазером, то большое количество незаполненных воздушных пространств и изменения показателя преломления в ткани, показанной оранжевым цветом, ограничивают силу сигнала из глубины ткани на результирующем изображении. Если вместо этого лист установлен в пофторолинейный или PFD, результирующее лазерное возбуждение флуорофора менее ослабляется и позволяет лучше передавать излучаемые сигналы.

В конечном счете, использование сканирующей лазерной конфокальной микроскопии с монтажной средой PFD дает четкие изображения живых клеток внутри листа растения на глубине, которая более чем в два раза превышает возможную при использовании водной монтажной среды. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как фиксация или монтаж листьев и водных сред, заключается в том, что он уменьшает рефракцию в мезозаполнении и позволяет более точно визуализировать живые клетки глубоко внутри листа, что было проблематично. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы науки о растениях, такие как обращение к мезозаполнению, клеточной биологии и передаче сигналов in vivo, колонизация листьев патогенами и взаимодействия с патогенами, хотя этот метод может дать представление о фундаментальной биологии растений.

Его также можно применять к другим тканям с высокой степенью преломления, богатым воздушным пространством, таким как спирали прозрения или легкие позвоночных. Демонстрировать эту процедуру будет доктор Джордж Литтлджон из моей лаборатории To Mount Leaf. Образцы в PFD начинают с подготовки предметного стекла микроскопа с газопроницаемой прокладкой из полидиметилслоуна или P-D-M-S-P-D-M-S представляет собой вязкоупругий полимер, который может быть отлит для получения камеры, адаптированной к экспериментальным требованиям.

Уравновесьте PFD воздухом, встряхнув небольшой объем PFD в бутылке, наполненной воздухом. Это также может быть достигнуто путем пропускания пузырчатого воздуха через PFD далее, сцеживания PFD в открытую чашку Петри и опускания целого проростка или акцизного листа на жидкость в течение пяти минут. Ткань должна стать полупрозрачной, напоминающей витрифицированную ткань.

Листья могут казаться темнее или светлее, чем до воздействия PFD, в зависимости от условий освещения и возраста используемой ткани. Наконец, заполните камеру PDMS аэроприравненным PFD и осторожно перенесите образцы тканей из инкубационной чашки Петри в камеру PDMS. Запечатайте предметное стекло крышкой, слипом и изображением.

Согласно экспериментальным требованиям, месячные листья инкубировали в течение пяти минут в суспензии рекомбинантного зеленого флуоресцентного белка или GFP. При микроскопическом исследовании образцов инкубированных листьев PFD видно, что большинство воздушных пространств заполнены рекомбинантным GFP, взвешенным в PFD. Зеленым цветом обозначен GFP, а красным — хлорофил, флуоресценция лото и мезозаполненные клетки.

Очевидно, что лист затопляется при инкубации с PFD, но иногда могут оставаться карманы воздуха. Здесь листья опсиса, экспрессирующие Венеру, вариант YFP, который локализуется в цитозоле, инкубируются и устанавливаются в воздушном, водном или PFD лазерном сканировании. Конфокальная микроскопия образцов показывает преимущество ПФД перед воздухом и водой при примерно двукратном увеличении глубины визуализации.

При сравнении PFD и воды После освоения этой техники можно выполнить за 5-10 минут при правильном выполнении. При выполнении этой процедуры важно помнить, что периферический делин растворяет лак для ногтей и тефлон, но совместим с силиконовой смазкой. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как использовать per fluro delin в качестве монтажной среды для улучшения визуализации в клетках листьев растений.

Не забывайте, что, хотя Per Fluoro delin не токсичен, мы рекомендуем придерживаться стандартных правил безопасности при выполнении этой процедуры.