Количественное сравнение СНГ-Регуляторного элемента (CRE) Деятельность в Трансгенные Дрозофилы

Общая цель этой процедуры заключается в количественном измерении генной регуляторной активности регуляторных элементов CIS или активной CRE во время гастроморфического метаморфического развития дрозофилы melan. Начните с методов интеграции, специфичных для конкретного сайта, для создания линий трансгенно инкорпорированных CRE в качестве репортерных трансгенов. С помощью стереомикроскопа получить трансгенные образцы правильной стадии развития.

Извлеките образцы из внешнего пабока и установите их на стеклянный микроскоп. На слайде можно записать уровень и характер экспрессии флуоресцентного репортерного белка в целых образцах с помощью конфокального микроскопического анализа. Наконец, количественно оцените уровень экспрессии флуоресцентного репортерного белка для записанных конфокальных изображений с помощью программного инструмента Image J.

Эти результаты определяют уровень регуляторной активности генов для содействия регуляторному элементу и облегчения дальнейших сравнительных исследований экспрессии генов на модифицированных версиях CRE. Эта процедура может помочь ответить на ключевые вопросы и проявить интерес к регуляции генов и к тому, как эта регуляция генов кодируется. ДНК ощущается как биология развития и эволюционная биология.

Эта процедура была разработана для того, чтобы получить представление о цис-регуляторных элементах, которые функционируют во время метаморфического развития дрозофилы melanogaster. В принципе, однако, он может быть применен к цис-регуляторным элементам, которые функционируют на других стадиях развития, и к другим видам плодовых мушек или даже к другим модельным организмам. Чтобы расширить трансгенные линии, установите две пробирки с несколькими самцами и самками мух через чередование дней.

Переложите мух из одного из флаконов в новый флакон. Повторяйте так в течение недели. К концу двух недель убедитесь, что трансгенные плодовые мушки варьируются от личиночных до взрослых стадий развития.

Приступайте к стадированию образцов в конце личиночной стадии третьего возраста, когда формируется ER. Обратите внимание, что образец неподвижен. ER размягчен в белом цвете, а сферические формы отсутствуют, указывают на этот момент времени.

Как ноль HAPF. Отличает самцов от самок наличием двусторонне расположенных гонад вблизи середины тела, которые выглядят как полупрозрачные круги для определения стадий в зависимости от длины метаморфоза. При нулевом HAPF перенесите образцы в свежий флакон с помощью увлажненной кисти.

Добавьте кусочек кима, протрите и смочите водой, чтобы экземпляры не высохли. Теперь инкубируйте флакон при температуре 25 градусов Цельсия до желаемого HAPF. В качестве альтернативы образцы подвергают сортировке на основе идентификации наличия и положения нескольких морфологических маркеров, как подробно описано в сопроводительном тексте.

С помощью лабораторной ленты приклейте кусок упаковочной ленты к препарирующей доске поверхностью липкой ленты вверх. Намочите малярную кисть и нанесите влагу на образцы с помощью малярной кисти. Переложите образцы на салфетку Кима.

Перенесите образцы на упаковочную ленту и приклейте их тыльной поверхностью лицевой стороной вверх. Дайте экземплярам высохнуть в течение 15 минут. Постепенно открывайте отделение неотложной помощи с помощью щипцов.

Начните с передней или химической завивки и двигайтесь к заднему концу. Затем перенесите пуй в каплю вязкого масла на предметное стекло микроскопа и оцените образец под микроскопом на предмет целого монтирования образцов. Используйте либо Forex, либо 10-кратный объектив, чтобы сфокусировать образец.

С помощью программного обеспечения конфокального микроскопа отрегулируйте длину волны возбуждения для нужного флуоресцентного белка, чтобы предотвратить фотообесцвечивание. Начните с интенсивности лазера от 5 до 10%Если сигнал не впечатляет, то увеличивайте интенсивность по мере необходимости, чтобы улучшить соотношение сигнал/шум. Для конфокальных изображений включите программные настройки, которые усредняют измерения пикселей из повторяющихся сканов, такие как усреднение по Калману для количественного сравнения активности CRE использует С-сечение, где флуоресценция проявляется наиболее интенсивно.

Переключитесь на таблицу поиска предупреждений о насыщенности и отрегулируйте усиление и смещение напряжения канала в соответствии с настройками, при которых насыщено мало пикселей. При необходимости отрегулируйте конфокальную диафрагму. После того, как оптимальные настройки определены, запустите сканирование ZS, чтобы получить серию изображений по оси Z.

Когда сканирование будет завершено, преобразуйте стек изображений в проекцию и сохраните этот файл изображения в формате TIF. Для количественного сравнения активностей CRE используйте одни и те же конфокальные настройки для всех реплицируемых образцов и репортерных трансгенных линий. Для начала эксперимента с программой Image J необходимо открыть изображение в формате TIFF для оценки.

Нажмите кнопку выбора от руки и обведите контуром область образца, в которой требуется количественное определение. Чтобы получить статистику значений в пикселях, перейдите на вкладку «Анализ» и выберите «Измерить». Запишите среднюю оценку значения в пикселях из поля результатов.

Также соберите второе среднее значение в пикселях из фоновой области, где CRE не активна. Чтобы получить скорректированное среднее значение в пикселях, продолжайте создавать статистику значений в пикселях для повторяющихся образцов. Затем на основе скорректированных репликой средних значений пикселей определите среднюю регуляторную активность для A CRE и также вычислите стандартную ошибку среднего значения.

В этом эксперименте используется интенсивность фенотипа белого спасательного глаза, чтобы сделать трансгенные линии гомозиготными. Генетический фон с мутантным белым геном и последовательностью сайта посадки A TTP используется для сайт-специфической трансгенной интеграции. Трансгенные индивидуумы, гемизиготные и гомозиготные по интегральному вектору различаются по интенсивности фенотипа спасенной окраски глаз по количеству копий интегрированного гена мини-белка.

Гомозиготные линии затем устанавливаются путем скрещивания самцов и самок мух с фенотипом самого темного цвета глаз. Морфологические маркеры используются для определения стадии метаморфизма дрозофилы при превращении из личинки во взрослую плодовую муху. Образец проходит через ряд стереотипных морфологий, которые могут быть использованы для определения пола и приближения стадии развития. Здесь.

Дикий тип A CRE, называемый диморфным элементом, приводит к высоким уровням экспрессии репортера EGFP в абдоминальном сегменте ASIC самок пуи. Было обнаружено, что последовательность из 13 пар оснований в этом CRE является сайтом связывания для транскрипционного фактора DSX, и важность этой последовательности in vivo демонстрируется путем количественной оценки регуляторной активности для CRE при мутации этого сайта связывания. Количественный анализ показывает, что мутация этого сайта DSX снижает регуляторную активность до 28 плюс-минус 3% от экспрессии дикого типа в контексте используемого здесь сайта трансгенной вставки.

Подобные сравнения оценивают регуляторную активность для внутривидовых аллелей CRE или между аутологичными CRE от отдельных видов, например, по сравнению с уровнями EGFP в женском сегменте. Шестерка, приводимая в движение желудочным Canin S штаммом D, аутологичные CRE для стимуляторов вида D и D. willi обладают регуляторной активностью, равной 75 плюс-минус 4% и ноль плюс-минус 0% соответственно. Следующие методы процедуры, такие как РНК-интерференция, могут быть использованы с генами фактора транскрипции, чтобы ответить на дополнительные вопросы о том, как эти гены фактора транскрипции взаимодействуют с регуляторными элементами CYS.

На это указывает увеличение и уменьшение экспрессии флуоресцентного репортерного белка, которые обусловлены регуляторными элементами CIS после его разработки. Эта процедура проложила путь исследователям в области регуляции генов к изучению функционального значения, которое мотивы цис-регуляторных элементов и эволюционировавшие мутации оказывают на экспрессию генов.