Мониторинг киназы и фосфатазы деятельности путем клеточного цикла Логометрический FRET

В этом видео активность киназы и фосфатазы контролируется на протяжении всего клеточного цикла с помощью передачи энергии Forrester Resonance или лада. Здесь зонд активности поло, такой как киназа один или LK one, имеет голубой флуоресцентный белок CFP, расположенный на одном конце, и желтый флуоресцентный белок YFP, размещенный на другом. Этот зонд трансфицируется в клетки U2 OS.

Затем, чтобы изучить статус фосфорилирования мишеней LK one во время перехода G two two two M, трансфицированные клетки U2 OS подвергают замедленной флуоресцентной визуализации. Когда CFP и YFP находятся в непосредственной близости и CFP возбуждается, энергия передается YFP, и можно обнаружить поступление YFP. Однако, когда зонд фосфорилируется, подтверждающее изменение в белке разделяет CFP и YFP.

Теперь, когда CFP возбуждается, обнаруживается сильное излучение CFP и только слабое излучение YFP. Количественная оценка соотношения излучения YFP после возбуждения CFP и YFP показывает, что активность PLK one увеличивается в Gtwo и достигает пика во время митоза. Таким образом, основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как стандартное геометрическое пленование, заключается в том, что особое внимание уделяется тому, чтобы клеточный цикл не нарушался ни условиями съемки, ни экспрессией зонда. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области клеточного цикла, такие как где и когда активируются определенные киназы или фосфатазы.

Хотя этот метод может дать представление о ферментах, регулируемых клеточным циклом, он также может быть применен к другим системам, где требуются неразрешенные условия, таким как анализы пролиферации клеток. Для мониторинга клеточного цикла человека клетки U2 OS трансфицируются с помощью зонда активности PK one на основе лада. Используя стандартный метод трансфекции фосфата кальция, клетки отбирают в пур-мицине в течение не менее семи дней.

Это обогащает популяцию клеток, экспрессирующих зонд, и ограничивает количество клеток с токсичными уровнями экспрессии или уровнями экспрессии, которые серьезно влияют на клеточный цикл. Затем стабильные клоны отбирают путем ограниченного разведения, экспрессию CFP, а затем исследуют YFP, чтобы убедиться, что они присутствуют во всех клетках примерно в одинаковом соотношении. Если некоторые клетки содержат только CFP или в этом случае, вероятно, произошла рекомбинация YFP, повторите приготовление плазмиды с использованием бактерий, которые менее склонны к гомологичной рекомбинации, например, затем две клетки линеаризируют плазмиду и повторите трансфекцию.

Как только клетки стабильно экспрессируют зонд, посадите их на стеклянные донные чашки под номером 1,5 после того, как они прикрепятся и сгущены на 30-50%. Измените среду на ту, которая не зависит от CO2 и не содержит фенолового красного, установите клетки на моторизованный эпифлуоресцентный микроскоп с контролем температуры, установленным на 37 градусов по Цельсию. Микроскоп должен быть оснащен фильтрами возбуждения и излучения CFP и YFP.

Зеркало ROIC, подходящее для мониторинга CFP и YFP, и объектив, подходящий для требуемого разрешения. Здесь используется воздушный объектив 20 x NA 0,75. С помощью проходящего света сфокусируйте клетки.

Не используйте флуоресцентный свет на этом этапе, так как он вызовет реакцию на стресс, которая может нарушить клеточный цикл. Чтобы избежать фототоксичности, установите изгиб на максимально возможное значение, позволяющее достичь требуемого субклеточного разрешения. Для этого эксперимента должна быть возможность различить ядро и цитоплазму.

Установите короткое время выдержки и вставьте фильтр с высокой нейтральной плотностью. Затем получите 12 или 16-битное тестовое изображение Используя возбуждение и излучение YFP, отрегулируйте время экспозиции и фильтры нейтральной плотности таким образом, чтобы средняя интенсивность в ячейке была примерно равна интенсивности фона плюс пятикратная разница между минимальной и максимальной интенсивностью фона. Чтобы убедиться в том, что изображения не являются насыщенными, изучите интенсивность флуоресценции для образца изображения.

Максимальная интенсивность изображения должна составлять менее половины динамического диапазона, чтобы учесть различия в интенсивности при вступлении клеток в митоз. Далее повторите этот процесс с помощью фильтров возбуждения CFP и излучения YFP. Выберите несколько областей с трансфицированными клетками, исключая области, используемые для фокусировки и оптимизации условий воздействия.

Поскольку эти процедуры могут вызвать реакцию на стресс, убедитесь, что максимальная интенсивность составляет менее половины динамического диапазона во всех клетках. Дайте указание программному обеспечению получать два изображения каждые 45 минут, используя возбуждение YFP, излучение YFP и возбуждение CFP. Фильтры излучения YFP.

Также установите общую продолжительность эксперимента, превышающую продолжительность клеточного цикла. Как только все будет готово, начните получение изображений после завершения сбора, откройте полученные изображения и отслеживайте время клеточного цикла от митоза до митоза. Для клеток, которые экспрессируют трансфицированный зонд, время клеточного цикла составляло примерно от 20 до 25 часов.

Сравните эти данные с контрольными данными для используемого типа ячейки. Если время клеточного цикла соответствует эталонному времени, то можно проанализировать лад. После того, как время будет проверено, изображения можно будет проанализировать.

Анализ может быть выполнен с помощью большинства программ, предназначенных для микроскопии. Здесь используется бесплатное изображение j с плагином ratio plus. Начните анализ, открыв изображения на изображении J. Если изображения имеют многоцветный формат стека, разделите отдельные каналы, преобразовав их в гиперстек

Затем гиперстек, затем стек на гиперстек. Откроется окно преобразования в гиперстек с отображаемыми настройками, нажмите OK. Теперь изображение будет отображаться с двумя ползунками под ним.

Далее, чтобы разбить изображения на одноканальные стеки, нажмите на изображение и выберите гиперстек уменьшить размерность. Это откроет окно сокращения, убедитесь, что выбраны кадры и сохранить источник. Затем нажмите «ОК».

Появится новое изображение, содержащее только один канал. Повторите этот процесс, чтобы получить новое изображение со вторым каналом. Далее, чтобы повысить визуальную четкость итоговых изображений, выберите стек излучения YFP возбуждения YFP.

Нажмите на процесс, затем нажмите на математику. Затем умножьте Когда откроется окно умножения, введите три, чтобы умножить стек излучения YFP возбуждения YFP на три. Этот шаг является необязательным и гарантирует, что отношения не находятся в диапазоне от нуля до единицы.

Затем на панели инструментов J изображения выберите инструмент от руки. Затем в стеке возбуждения YFP, излучения YFP нарисуйте область интереса или ROI в области, которая лишена ячеек, но которая находится близко к ячейке, которая будет измеряться, чтобы добавить ROI в менеджер ROI, нажмите на инструменты анализа. Затем менеджер по ROI.

Появится окно менеджера ROI. Нажмите кнопку «Добавить», чтобы сохранить координаты ROI для измерения средней интенсивности ROI в стеке излучения YFP возбуждения YFP. Нажмите «Анализировать», затем выберите «Измерить».

Откроется окно с результатами. Выберите стек эмиссии CFP excitation YFP. Затем дважды кликните по ROI в менеджере ROI и повторите измерение.

Результаты измерения будут добавлены в окно результатов. Прокрутите до других мест в стеке, чтобы повторить этот процесс в нескольких временных точках. Убедитесь, что интенсивности фона вблизи интересующей клетки одинаковы по всей пленке, сравнив измерения в окне результатов.

Чтобы установить измерения с минимальной интенсивностью, нажмите «Анализировать», затем нажмите «Установить измерения» и укажите минимальное и максимальное значение серого. Далее появится окно с альтернативными измерениями. После регулировки яркости и контрастности по мере необходимости нарисуйте ROI, охватывающий большую часть ячейки, и измерьте минимальную интенсивность в обоих стеках.

Затем проведите измерения, как и раньше, на этот раз используя клетку вместо фона. Используя значения из секций результатов, вычислите разницу между измеренной минимальной интенсивностью и интенсивностью фона и разделите ее на два. Это дает начальную оценку значения отсечения к коэффициенту открытия плюс выбранные плагины.

Тогда соотношение плюс. Затем для соотношения ладов выберите CFP возбуждение YFP излучение S стек один или для инвертированного отношения ладов, визуализируя преобразователи, где эффективность лада снижается при фосфорилировании. Выберите YFP возбуждение YFP излучение S стек один, чтобы вставить измеренные интенсивности фона и значения клиппинга.

Используйте значения из окна результатов и вставьте их в окно соотношения плюс. Задайте масштаб полученного стека коэффициентов и примените подходящую таблицу поиска для визуализации изменений коэффициентов. Клетки U2 OS, экспрессирующие зонд на основе ладов, отслеживающий активность PLK one, снимались в течение 60 часов, как описано в этом видео.

На этом изображении показан кумулятивный митотический вход 50 ладовых зондов, экспрессирующих клетки, включая деления дочерних клеток. Большинство клеток, экспрессирующих зонд, пролиферируют с временем клеточного цикла от 20 до 25 часов, что указывает на то, что условия визуализации и уровни экспрессии зонда не влияют на время клеточного цикла. Представление в ложном цвете инвертированного отношения ладов после того, как одна клетка проходит через четыре деления, демонстрирует, что, несмотря на наличие значительного шума, наблюдается тенденция, при которой активность PK one увеличивается в G-2 и достигает пика во время митоза.

Когда исходные данные отфильтрованы и представлены в виде графика, время между пиками активности легко оценить. На этом рисунке показана количественная оценка перевернутого отношения ладов ячейки, показанной на предыдущих изображениях графика. Время активации можно оценить, и, как видно здесь, фосфорилирование зонда становится видимым примерно за четыре часа до того, как фосфорилирование достигает пика в митозе.

Во время этой процедуры важно поддерживать клетки в ненапряженном состоянии, поэтому это делается путем минимизации воздействия света, а также минимизации изменений температуры или pH. Также важно помнить, что этот метод контролирует баланс между активностью киназы и фосфатазы в клетке. Эта процедура может быть объединена с РНК-интерференцией или ингибиторным скринингом для идентификации регуляторов этих киназ и фосфотаз, предшествующих им.