Флуоресценции на основе измерения магазин управлением поступления кальция в живых клетках: от искусственного раковых клеток в скелетных мышечных волокон

Данный экспериментальный метод используется для выявления свойств внутриклеточного входа ионов кальция, регулируемого запасами (SOCE), в раковых клетках и клетках скелетных мышц с помощью методов флуоресценции. Это достигается путем регистрации флуоресценции URA two в живых клетках, которая чувствительна к концентрации внутриклеточного кальция. Кроме того, для изучения SOCE измеряется скорость тушения флуоресценции при добавлении марганца на длине волны, нечувствительной к концентрации кальция, что напрямую отражает активацию SOCE.

В структурно специализированных клетках скелетных мышц проводят диссекцию и удаление оболочек мышц. Подготавливают мышечные волокна. Затем волокна обрабатывают низкоаффинными индикаторами кальция и осуществляют мониторинг их внутренней флуоресценции.

Эти методы демонстрируют, что SOCE существует как в невозбудимых клетках, так и в скелетных мышцах с градуированной активацией и тесной связью с содержанием кальция во внутриклеточных депо. Основным преимуществом данного метода на основе флуоресцеина перед другими методами, такими как электрофизиология и метод локальной фиксации мембраны (patch clamp), является удобство в использовании, а также возможность применения для изучения популяций клеток или высокопроизводительного скрининга. Важно использовать подходящие условия для обеспечения стабильной среды и точности проведения анализа.

Таким образом, калибровка каждого отдельного прибора имеет решающее значение, поскольку каждый прибор индивидуален. Визуальная демонстрация этого метода критически важна, так как процесс выделения одиночных мышечных волокон трудно освоить, поскольку он требует специального практического обучения, глубокого понимания и изучения методов микродиссекции, тщательного наблюдения и большого терпения. Перед началом работы откалибруйте систему микроскопии для измерения флуоресценции URA2. Хотя длины волн возбуждения для связывания кальция и кальция-URA2 составляют 340 и 380 нм, наилучший динамический диапазон соотношения URA2 для измерения уровня кальция в конкретной системе микроскопии может достигаться при других длинах волн.

Такие сдвиги длин волн обусловлены изменениями оптического пути при добавлении различных дополнительных оптических компонентов. Аналогично, для каждой системы варьируется и изосбестическая точка. Следовательно, важно определить эти длины волн с помощью сканирования спектра.

В качестве альтернативы, скрининг может быть зарегистрирован с помощью флуоресценции на любых двух длинах волн таким образом, чтобы итоговое значение не зависело от концентрации кальция. Начните с трансфекции культивируемых клеток K Ys SE (около 50 клеток) плазмидами, экспрессирующими RFP и содержащими либо HRNA, специфичную против I one, либо скрамблированную последовательность, в течение 48 часов. Выращивайте трансфицированные клетки в чашках с There стеклянным дном.

Затем удалите среду и промойте клетки сбалансированным солевым раствором (BSS). После промывки добавьте один миллилитр BSS, содержащего две микромолярные RA 2:00 AM, и выдержите чашку при температуре 37 °C в течение 40 минут. Оставьте клетки при комнатной температуре на 15 минут, чтобы форма URA 2:00 AM внутри клеток конвертировалась в URA two.

Затем дважды промойте планшет раствором BSS под микроскопом. В режиме визуализации выберите клетки, экспрессирующие RFP. Выберите режим отношения возбуждения, установив длину волны эмиссии на 510 нанометров, а длины волн возбуждения — на 350 и 390 нанометров.

Отношение отображается в третьем окне. Далее произведите запись флуоресценции выбранных клеток на заданных длинах волн во время перфузии клеток четырьмя различными растворами.

Аналогичным образом, клетки KYSE one 50 загружают ферра two и подвергают регистрации. В режиме отношения возбуждения, в отличие от предыдущей процедуры, в качестве длины волны возбуждения выбирают ISO spastic point 360 nanometers. Затем одновременно регистрируют флуоресценцию при 360 и 390 nanometers, в то время как клетки перфузируют пятью различными растворами BSS.

Для данного протокола клетки C2C12 (мышиная миогенная клеточная линия) должны быть выращены на планшетах со стеклянным дном до достижения конфлюэнтности, а затем дифференцированы в миотрубки в дифференцировочной среде, содержащей 2,5% сыворотки лошади. Обработайте миотрубки C2C12 RA 2:00 AM в растворе BSS до конечной концентрации 5 µM и инкубируйте в течение 40 минут. Затем добавьте бензотиолмид (BTS) до конечной концентрации 20 µM для ингибирования мышечных сокращений и вызванных ими артефактов движения.

Инкубируйте клетки в течение 15 минут при комнатной температуре; все растворы должны содержать BTS. Затем залейте сбалансированный солевой раствор в систему перфузии.

Как было описано ранее. В ходе каждой перфузии регистрируйте флуоресценцию выбранных клеток при 360 и 390 нанометрах. В этой серии магний и thap argen вводятся совместно для мониторинга тушения ионов магния.

В то время как запасы кальция в эндоплазматическом ретикулуме истощаются. Чтобы выделить мышцу длинного разгибателя пальцев (EDL), положите ногу эвтаназированной мыши латерально и удалите кожу от области лодыжки до колена. Рассеките поверхностные мышечные слои ткани, чтобы обнажить EDL, и перережьте верхнее и нижнее сухожилия, чтобы освободить целую мышцу EDL.

Важно максимально сохранить длину сухожилий. Чтобы предотвратить сокращения, перенесите EDL в раствор T-road, содержащий 0,1 миллимоляр EGTA и не содержащий кальция, используя стереомикроскоп. Разделите сухожилия в месте прикрепления к коленному суставу на две половины и разделите мышцу EDL на два пучка.

Повторяйте процесс до получения восьми пучков. Если в каком-либо пучке утрачены сухожилия, такой пучок следует выбросить. Затем захватите оба сухожилия полоски пучка EDL и осторожно растяните полоску до тех пор, пока не останется три или четыре отдельные целые мышечные волокна с сохранившейся тканью сухожилия с обеих сторон.

Поместите каплю тирового буфера без кальция в чашку с стеклянным дном. Разложите полоски EDL прямо на чашке и быстро удалите максимально возможный объем раствора. Затем плотно зафиксируйте оба сухожилия с помощью водостойкой клейкой ленты.

Сначала промойте волокно раствором, не содержащим кальций, а затем дважды раствором кальция с концентрацией 2,5 мМ. Если наблюдается гиперсокращение или повреждение волокна, замените его; выбранные здоровые мышечные волокна промойте трижды промывочным раствором номер один, а затем выдержите их в модифицированном растворе для скиннинга, имитирующем внутриклеточную среду, в течение пяти минут. Используя вольфрамовую иглу, закрепленную в держателе, проведите механический скиннинг волокна под стереомикроскопом; после этого волокна закроются, удерживая Rhod 5N, конъюгированный с кальцием, в поперечных трубках.

Получение здоровых одиночных целых мышечных волокон или, по крайней мере, пучков таких волокон, к которым все еще прикреплен фрагмент сухожилия, по моему мнению, является одним из самых сложных этапов, за которым следует всегда очень трудоемкий перенос этих волокон в окончательную экспериментальную камеру. В ходе этого процесса волокна могут подвергнуться гиперсокращению или даже разорваться. Поэтому, если у вас есть здоровые волокна, сам процесс механического скиннинга будет проходить гораздо легче. Инкубируйте волокна в растворе для скиннинга с 20 µM флоуризена.

После инкубации проведите тщательную промывку с использованием промывочного раствора номер два, затем проведите дополнительную 30-минутную инкубацию для полного деэстерифицирования красителя. После этого волокна в интересующих областях можно визуализировать с помощью конфокального микроскопа с 60-кратным объективом. Одновременно регистрируйте флуоресценцию каждого красителя, пока волокно перфузируют растворами для загрузки и истощения SR.

Активность SOCE в клетках KYS, SE one 50 была исследована с помощью измерения внутриклеточного кальция. Клетки были ко-трансфицированы RFP и коротким шпилечным РНК против гена OR I one, кодирующего канал A-S-O-C-E, по сравнению с контролем, представленным черной линией. Нокдаун экспрессии OR I one привел к снижению активности SOCE. Активность SOCE в клетках KYC one 50 также была подтверждена методом гашения флуоресценции марганцем. После полного истощения запасов кальция в ЭР с помощью TG перфузия марганцем привела к значительному снижению флуоресценции.

Более крутой наклон кривой потери сигнала URA в группе two указывает на более активный SOCE. Таким образом, медленное снижение флуоресценции в клетках, обработанных two A PB, свидетельствует о том, что активность SOCE была заблокирована данным соединением. Скорость тушения марганцем определялась по первым 10 секундам, когда тушение все еще находилось в линейном диапазоне без насыщения; аналогичный анализ тушения марганцем был проведен на культивируемых мышечных клетках.

В данном случае марганец вводили совместно с tg. Пока TG истощал запасы кальция в SR, наклон тушения флуоресценции постепенно менялся до тех пор, пока не достиг своей максимальной скорости. Сигмовидная кривая указывала на градуированную активацию SOCE в данных экспериментальных условиях.

При конфокальном сканировании захват Rhod 5N и dye в Т-трубочковом отделе продиктованного волокна продемонстрировал характерный для млекопитающих паттерн дублетов, видимый в красном канале. После загрузки саркоплазматического ретикулума (СР) с Fluo 5N в зеленом канале при перфузии продиктованного волокна загрузочным раствором для СР стал виден типичный точечный паттерн СР. Интенсивность флуоресценции как Rhod 5N, так и Fluo 5N увеличилась при перфузии раствором для истощения СР, после чего уровни флуоресценции в отделе СР и в Т-трубочковом отделе начали снижаться. Это указывало на наличие связи между истощением запасов кальция в СР и активацией SOCE соответственно.

После просмотра этого видео вы должны будете иметь четкое представление о том, как получить жизнеспособные, здоровые и неповрежденные мышечные волокна. На их концах должно оставаться достаточное количество сухожилия, чтобы обеспечить эффективный процесс очистки, что в конечном итоге позволит исследователю получить физиологически релевантный препарат, обладающий значительным преимуществом. Не забывайте, что все флуоресцентные красители, используемые в данном исследовании, обычно чувствительны к свету, поэтому при выполнении этой процедуры следует всегда соблюдать такие меры предосторожности, как помещение образцов в чашки в темноте и промывка в темной комнате.

Освоение этой методики занимает несколько часов. Мы рекомендуем сначала получить несколько целых волокон, чтобы повысить процент успеха при выполнении этапов механического разделения, а также если вы планируете культивировать эти волокна в течение ночи после их выделения. Данный метод открыл исследователям в области передачи кальциевых сигналов путь к изучению роли кальциевого входа, управляемого запасами, в процессах роста и гибели раковых клеток.

Физиологические и патологические функции в мышцах.