Распространение и обнаружение инфекционных молекулярной Клон Maedi-visna Касперского, которые выражает зеленый флуоресцентный белок

Общая цель данной процедуры заключается в размножении и детекции инфекционного клона вируса Mildy в сравнении с контролем без вируса, экспрессирующего зеленый флуоресцентный белок. Этот зеленый флуоресцентный белок был клонирован в ген оболочки D utp Ace в геноме вируса Myy Ner.

Инфекционный клон содержится в двух плазмидах. Сначала две плазмиды, несущие последовательности myy Ner, разрезают рестриктазой xpa one и лигируют. Затем клетки хориоидного сплетения овцы трансфицируют полученной конструкцией.

Наконец, клетки, инфицированные вирусом Myy vino, обнаруживают с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии. Здравствуйте, я Стефано Нерон из Института экспериментальной патологии при Университете Исландии. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру размножения и обнаружения инфекционного молекулярного клона сосудистого вируса Myy, экспрессирующего зеленый флуоресцентный белок.

Молекулярный клон содержится в плазмидах P8XSP5EGFP и P67or размером 12 kb и 4,5 kb соответственно. Перед трансфекцией проведите рестрикцию эквимолярных количеств двух плазмид, а именно 4,4 µg P8XSP5EGFP и 1,6 µg P67or с помощью XPA1, после чего выполните лигирование. По завершении лигирования инкубируйте смесь для лигирования при 65 °C в течение 15 минут. За два дня до трансфекции высейте 10⁶ клеток SCP в флакон для культивирования тканей T25 и выращивайте клетки в течение двух дней в 5 mL DMEM с добавлением 10% сыворотки ягненка и 2 mM глутамина без антибиотиков до достижения 90% конфлюэнтности монослоя.

Если спустя два дня клетки не достигли 90% CO, оставьте их расти еще на один день. Сыворотку ягненка можно заменить сывороткой плода говяжьего FBS. Мы регулярно используем сыворотку ягненка, так как некоторые штаммы MVV ингибируются FBS.

Однако данный штамм MVV не ингибируется FBS. Когда клетки будут готовы к трансфекции, замените среду на DMEM с 1% сыворотки ягненка или FBS без антибиотиков. Для трансфекции мы используем Lipofectamine 2000: разведите ДНК в 500 microliters среды Opti-MEM, разведите 20 microliters Lipofectamine 2000 в 500 microliters среды Opti-MEM и оставьте при комнатной температуре на пять минут.

После пятиминутной инкубации смешайте разведенную ДНК с разведенным lipofectamine 2000 до достижения общего объема 1000 microliters. Осторожно перемешайте и инкубируйте в течение 20–30 минут. При комнатной температуре добавьте смесь для трансфекции в флакон T 25 с клетками SCP и питательной средой, аккуратно покачивая его.

Инкубируйте при 37 °C и 5% carbon dioxide в течение ночи. На следующий день замените среду на DMEM с 1% serum, 2 mM glutamine, 100 IU/mL penicillin и 100 IU/mL streptomycin. Контролируйте экспрессию GFP в клетках SCP с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа.

Для этих первичных клеток ожидается низкая эффективность трансфекции, обычно от 5% до 15%. Продолжите инкубацию при 37 °C и 5% carbon dioxide в течение нескольких дней, чтобы вирус распространился по колбе. Полное заражение обычно занимает от 7 до 14 дней. Соберите вирус, перенеся супернатант в пробирки Эппендорфа.

Центрифугируйте в микроцентрифуге при 3000 об/мин в течение пяти минут для удаления клеточного дебриса. Перенесите супернатант, содержащий вирус, в новые пробирки.

Посейте 3×10⁴ клеток SCP, хранившихся при -80 °C, в объеме 100 µL среды DMEM с добавлением 10% сыворотки, 2 mM глутамина, 100 IU/mL пенициллина и 100 IU/mL стрептомицина на каждую лунку.

Инкубируйте клетки в 96-луночном планшете при 37 °C и 5% CO2. Если на следующий день клетки достигнут конфлюэнтности, замените среду на DMEM с 1% сыворотки. При наличии 100 µL в каждой лунке разведите вирус следующим образом.

Добавьте по 180 мкл DMEM с 1% сыворотки в четыре ряда по 10 лунок в 96-луночный планшет с круглым или V-образным дном для проведения серийного десятикратного разведения в четырех повторах. Добавьте по 20 мкл вируса в каждую из четырех лунок первого столбца планшета. Затем, используя четырехканальный дозатор, произведите перемешивание путем аспирации и диспенсирования образца до достижения полной однородности.

Смените наконечники пипеток и перенесите по 20 µL в следующие четыре лунки и так далее. Оставьте последние лунки без вируса для отрицательного контроля. Добавьте 100 µL разведения вируса к клеткам SEP и поместите в инкубатор.

37 °C и 5% углекислого газа. В течение двух недель наблюдайте за флуоресценцией GFP и цитопатическими эффектами. Цитопатические эффекты характеризуются округлением клеток и снижением их прозрачности по сравнению с нормальными клетками с отростками, что завершается появлением многоядерных клеток и гибелью клеток.

Рассчитайте титр вируса методом Рида-Мюнча для быстрого мониторинга репликации вируса. Инфицированные клетки можно исследовать с помощью проточной цитометрии с применением трипсина. Наблюдается примерно 10⁵ инфицированных клеток.

Однократно промойте PBS и ПЕРЕВЗВЕСИТЕ в 500 µL PBS. Добавьте 500 µL 4% раствора параформальдегида (конечная концентрация 2%) и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут. Осадите клетки центрифугированием при 3000 rpm в течение пяти минут.

Промойте дважды в PBS по пять минут и проведите анализ на анализаторе FactScan. Отсчитайте 10 000 событий. Экспрессирующий GFP молекулярный клон моего вируса, представленный здесь, может быть полезен для анализа взаимодействий вируса с хозяином и патогенности моего нейровируса как in vivo, так и in vitro.

Хотя не было показано, что мой нейровирус может воздействовать на клетки человека, важно соблюдать все меры предосторожности соответствующего уровня биологической безопасности; и клетки, и плазмида могут быть получены в нашей лаборатории. Желаю удачи в ваших экспериментах.