Визуализация сосудистой Са ^{2 +} Сигнализация Срабатывание паракринной Производные ROS

Общая цель этой процедуры заключается в визуализации сосудистой передачи сигналов кальция, вызванной перикринными активными формами кислорода или ros. Это достигается путем предварительной визуализации R os с использованием чувствительных к окислению красителей в активных макрофагах. АФК также можно визуализировать в эндотелиальных клетках с помощью флуоресцентных сенсоров на основе плазмид.

Затем приступайте к одновременной визуализации клеточного трекера, помеченных красным цветом активированных макрофагов и гриппа четырех меченых эндотелиальных клеток в модели совместного культивирования. Наконец, измерьте передачу сигналов кальция в эндотелиальных клетках, вызванную Ros, полученным из макрофагов. С помощью системы конфокальной визуализации.

Эти результаты могут продемонстрировать уровни Ros независимо друг от друга, а также одновременно оценить внутриклеточную мобилизацию кальция, вызванную АФК, полученной от Peregrine. Этот метод позволяет одновременно оценивать две различные сигнальные молекулы, которые непосредственно вызывают сосудистую сигнализацию и симуляцию патофизиологической обстановки. Два постдока в моей лаборатории, Картик и Радж, продемонстрируют процедуру измерения исходного сырья и кальция, а также взаимодействия эндотелиальных клеток макрофагов.

Моноцитарный образец культуры мыши получен макрофагом на стеклянном дне 35 миллиметровой посуды. Затем проведите испытание клеток агонистами толл-подобных рецепторов и инкубируйте в течение шести часов при температуре 37 градусов Цельсия. Для визуализации цитозольное.

Добавьте чувствительный к окислению краситель и инкубируйте клетки в течение 20 минут. Теперь визуализируйте клетки на сцене с контролируемой температурой в системе конфокальной визуализации. В качестве альтернативы, чтобы визуализировать митохондриальные АФК в клетках, активированных TLR, добавьте индикатор митохондриального супероксида и инкубируйте клетки в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия.

Для отрицательного контроля обработайте клетки либо PBS, либо ДМСО для положительного контроля. Обработайте клетки двумя миллимолярными антимицинами. Продолжение визуализации всех клеток на сцене с контролируемой температурой системы конфокальной визуализации.

Используя программное обеспечение image J, проанализируйте все данные изображения. Флуоресцентный сенсор специфически определяет субмикромолярные концентрации перекиси, и на основе экспрессии млекопитающих векторный дизайн может быть направлен либо на цитоплазму, либо на митохондрии. С помощью электропорации можно создать стабильные линии легочных микрососудистых эндотелиальных клеток мыши, несущих неадекватную гиперэкспрессию плазмиды.

Для облегчения роста клеток колоний при низкой плотности в полной TMEM и инкубации в течение 48 часов замените среду на полную питательную среду с добавлением антибиотика селекции. Скрининг клонов на самый высокий процент гиперпозитивных клеток и амплификация культуры для создания стабильных гиперпозитивных линий в отдельных экспериментах. Семенные клетки на 0,2% желатиновом покрытии покрывают соскальзыванием и культивируют в течение ночи до 80% конфлюенции.

Теперь активируйте клетки с помощью лигандов TLR и инкубируйте в течение шести часов при температуре 37 градусов Цельсия. Для обнаружения цитоплазматической АФК установите покровные стекла клеток на камеру для клеток adelo. Добавьте один миллилитр предварительно прогретых баков, уравновесьте раствор соли и поместите камеру на температурный столик системы конфокальной визуализации.

Регистрируйте изменения флуоресценции в клетках для обнаружения митохондрий. ROS. Включите положительный контроль двух микромолярных антимицина А. Затем подготовьте покровные листы обработанных клеток для конфокальной микроскопии. Выполняйте анализ изображений с помощью программного обеспечения image J.

Начните с эндотелиальных клеток, выращенных до 80% конфлюенции на стеклянных покровных стеклах с желатиновым покрытием для визуализации и измерения внутриклеточных изменений кальция. Инкубируйте клетки в флуоресцентном красителе гриппа в 4:00 утра при комнатной температуре в течение 30 минут, чтобы свести к минимуму потерю красителя. Теперь монтажная крышка надевается на камеру адело-клетки с 800 микролитрами предварительно подогретого раствора для экспериментальной визуализации и помещает клетки на столик с контролируемой температурой системы конфокальной визуализации в отдельной пробирке.

Используйте 500 нанограмм на миллилитр клеточного трекера red C-M-T-P-X в течение 15 минут, чтобы пометить исследуемую популяцию макрофагов и ресуспендировать гранулы в 200 микролитрах экспериментального раствора для визуализации. Теперь добавьте помеченные макрофаги на грипп в 4:00 утра загруженный. Эндотелиальные клетки в конфокальной камере регистрируют зеленую и красную флуоресценцию каждые три секунды в течение 10 минут.

В этом эксперименте J 7 74 0,1 клетки подвергались воздействию двух, трех и четырех лигандов TLR в течение шести часов. Репрезентативные конфокальные изображения показывают повышенный цитозольный Ros, измеренный с помощью DCF. Интересно, что красная флуоресценция митозных носков указывает на аналогичное увеличение митохондриальной АФК.

Эти изменения флуоресценции носят количественный характер. Таким образом, результаты должны быть нормализованы и выражены в виде относительного изменения кратности при каждом лечении, сигнал антимицина А подтверждает положительный контроль продукции митохондриальных АФК. На этом рисунке показаны изображения уровней эндотелия, цитозольных и митохондриальных перекисей в стабильно экспрессирующихся гиперцитах или гипер D мито.

МП ЭКС стимулировали агонистами TLR. Количественное определение изменения средней флуоресценции демонстрирует увеличение гиперциторесценции и гиперфлуоресценции D-мито после шести часов стимуляции в системе совместного культивирования. Для оценки передачи сигналов Peregrine ROS свежевыделенные макрофаги мирина от мышей дикого типа и GP 91 Fox null были активированы одним микрограммом на миллилитр ЛПС в течение шести часов.

Макрофаги были помечены красным цветом с помощью C-M-T-P-X и добавлены к зеленому гриппу четыре. Нагруженный. MPM ecs. Интересно, что активированные ЛПС макрофаги, выделенные у мышей дикого типа, вызвали большую и быструю мобилизацию кальция у МПМ ЭКС по сравнению с макрофагами от мышей GP 91 Fox null.

При попытке проведения этой процедуры важно помнить, что либо длительное скачивание, либо воздействие лазера приводят к автоокислению DCF. Крайне важно избегать фотообесцвечивания гиперцитоцитарного и гипер-D-митрального уровней. После освоения РА измерение РА в макрофагах, а также в эндотелиальных клетках может быть выполнено за семь часов, если оно выполнено правильно.