Внутриклеточное Пробирной рефолдинг

Общая цель данного эксперимента — измерить шаперон-зависимый внутриклеточный белок, сворачивающийся после теплового шока. С помощью люциферазного репортера сначала трансфицируют клетки с плазмидами, покрывающими ген люциферазного репортера и интересующего его шаперона. Затем разделите трансфицированные клетки на точки времени восстановления в экспериментальном дизайне.

На следующий день тепловой шок вызывает у клеток разворачивание белка. Дайте восстановиться для восстановления внутриклеточного сворачивания белка, а затем измерьте активность люциферазы. Результаты измеряют зависящее от времени и шапероново зависимое сворачивание белка на основе анализа люциферазы.

Основным преимуществом этой методики перед существующими методами, такими как анализ повторного сворачивания in vitro, является возможность получения физиологического считывания влияния соединений или белков на активность шаперона. Применение этой техники распространяется на терапию широкого спектра заболеваний, таких как нейродегенеративные заболевания или рак, потому что шапероны играют важную роль в развитии этих патологий. Сначала разогрейте питательную среду, PBS и трипсин до 37 градусов Цельсия на водяной бане.

Промойте сливающуюся культуру HEK 2 93 клетками с пятью миллилитрами PBS. Затем нанесите один миллилитр трипсина, содержащего 0,025% ЭДТА, аккуратно поверните планшет для равномерного распределения трипсина и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия. Периодически встряхивайте пластину, чтобы убедиться в отслойке клеток.

Теперь суспендируйте клетки в 10 миллилитрах полной среды DMEM и перенесите в 50-миллилитровую соколиную пробирку. Затем перечислите ячейки с помощью счетчика Бекмана. Клетки имеют примерно от 60 до 70% плавности и инкубируются в течение шести-восьми часов.

Уравновесьте экстремальный ген, девять реагентов до комнатной температуры и аликвоту свободной сыворотки среды до 37 градусов Цельсия. Пипеткой нанесите свободную сыворотку среду в две эйноровые пробирки. Затем добавьте крайний реактив девятого гена, не касаясь стенки эйнора, инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре.

Тем временем приготовьте смеси для трансфекции 2D NA в первой пробирке, добавьте ванильный светлячок и пустой вектор контроля во вторую пробирку. Добавьте ванильного светлячка и молекулярный шаперон. Добавьте ДНК в реагент для трансфекции, перемешайте вихрь и инкубируйте при комнатной температуре в течение 20 минут.

Продолжайте добавлять эту смесь на пластинчатые клетки и инкубируйте в течение 24 часов. Соберите трансфицированные клетки с использованием семенных клеток трипсина при концентрации от 60 до 70% в шести луночных планшетах и оставьте их в инкубаторе на ночь. Отсасывайте среду от трансфицированных клеток.

Затем добавьте один миллилитр буфера для теплового шока и выдерживайте 30 минут. Чтобы остановить синтез белка Деново, запечатайте крышки полосками параформы и выдерживайте на водяной бане при температуре 45 градусов Цельсия в течение 30 минут. Теперь извлеките параформу и поместите клетки обратно в инкубатор для восстановления в указанные моменты времени.

Соберите клетки и промойте один раз в PBS Для эффективного начала лизиса клеток заморозьте клеточную гранулу в жидком азоте, добавьте 200 микролитров разбавленного буфера пассивного лизиса. Теперь аликвоты в трех экземплярах. 30 микролитров клеточного лизата на лунку 96-луночного планшета.

Чтобы оценить эффективность трансфекции, начните с образцов, не подвергшихся воздействию тока. Для измерения активности ран-люциферазы готовят свежий 0,2 миллимоляра люцифера в гли-гли-буферном реакционном буфере, содержащем один миллимоляр А ТП и 0,2 микромолярного эзинового реакционного буфера. Вставьте пластину на 96 лунок в люминометр и запустите программу.

Рабочая станция Wallach 1420. Введите насос в пробирку Falcon, содержащую 0,2 микромолярного эзинового реакционного буфера. Выберите в меню опцию обслуживания дозатора и отметьте галочкой насос один.

Выберите опцию заливки, чтобы отредактировать компоновку пластины. Выберите опцию, изучите протокол и результаты в меню. Выберите протокол.

Теперь выберите лунки для чтения. Вернитесь в Wallach Manager и нажмите «Пуск», чтобы измерить выбросы проб. На 482 нанометрах перейдите к обслуживанию дозатора и выберите пустой и насос одного, чтобы выпустить весь остаточный раствор обратно в пробирку.

Теперь переместите трубку к соколу, содержащему воду и клеща, промойте. Продолжите, выбрав пусто. Затем поместите трубку от первого насоса в реакционный буфер, а трубку от второго насоса в раствор ЛЮЦИФЕРА.

Измените схему расположения пластин. Выберите заливку для первого насоса и второго насоса. В меню обслуживания дозатора выберите протокол и начните измерение длины волны реакции люциферазы светлячка 560 нанометров.

По окончании повторения повторить процедуру, опорожнить, промыть, опустошить. Для первого и второго насосов просмотрите результаты в Wallach 1420 Explorer. Каждый эксперимент связан с анализом.

Нумеруйте, имя пользователя, дату начала и окончания, экспортируйте результаты в файл Excel. Для анализа рефолдинг белка напрямую связан со временем восстановления. В этом эксперименте клетки оцениваются в разные моменты времени после теплового шока.

При отсутствии и присутствии молекулярного шаперона. Как и ожидалось, процент свернутой люциферазы увеличивается с увеличением времени восстановления как в контрольной группе, так и в клетках, трансфицированных молекулярным шапероном. Напротив, недопустимый набор данных показывает плохие значения R в квадрате для корреляции между временем и сворачиванием.

Следуя этой технике, можно использовать другие методы, такие как анализ ТФА in vitro, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как ингибирование ферментативной активности шаперона. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как измерять внутриклеточный белок. Мы следуем за нами после шока от зацепки.