Внутриклеточное Пробирной рефолдинг

Общая цель данного эксперимента заключается в измерении внутриклеточного рефолдинга белка, зависящего от шаперонов, после теплового шока. Используя люциферазный репортер, сначала проведите трансфекцию клеток плазмидами, содержащими ген люциферазного репортера и интересующий шаперон. Затем разделите трансфецированные клетки по временным точкам восстановления, предусмотренным дизайном эксперимента.

На следующий день подвергните клетки тепловому шоку для индукции развертывания белков. Дайте клеткам восстановиться для возвращения белков в нативное состояние, затем измерьте активность люциферазного репортера. Результаты позволяют оценить зависимость рефолдинга белков от времени и присутствия шаперонов на основе люциферазного анализа.

Основным преимуществом данной методики по сравнению с существующими методами, такими как анализ рефолдинга in vitro, является возможность получения физиологического показателя влияния соединений или белков на активность шаперонов. Применение этой методики имеет значение для терапии широкого спектра заболеваний, включая нейродегенеративные заболевания и рак, поскольку шапероны играют важную роль в развитии этих патологий. Сначала прогрейте питательную среду, PBS и трипсин до 37 °C на водяной бане.

Промойте конфлюэнтную культуру клеток HEK 2 93 пятью миллилитрами PBS. Затем нанесите один миллилитр трипсина, содержащего 0,025% EDTA, осторожно вращайте планшет для равномерного распределения трипсина и инкубируйте при 37 °C. Периодически встряхивайте планшет для проверки открепления клеток.

Теперь снова суспендируйте клетки в 10 milliliters полной среды DMEM и перенесите их в фалькон-пробирку объемом 50 milliliters. Затем подсчитайте количество клеток с помощью счетчика Beckman. Расселите клетки до достижения примерно 60–70% конфлюэнтности и инкубируйте в течение шести-восьми часов.

Доведите реагент Extreme Gene Nine до комнатной температуры, а аликвоту безсывороточной среды — до 37 °C. Перенесите безсывороточную среду в две пробирки типа Eppendorf. Затем добавьте реагент Extreme Gene Nine, не касаясь стенок пробирки, и инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре.

Тем временем приготовьте смеси для 2D NA-трансфекции в первой пробирке, добавьте ran vanilla firefly и пустой вектор в качестве контроля во вторую пробику. Добавьте ran vanilla firefly и молекулярный шаперон. Добавьте ДНК в смесь с реагентом для трансфекции, перемешайте на вортексе и инкубируйте при комнатной температуре в течение 20 минут.

Продолжайте добавлять эту смесь к клеткам на планшете и инкубируйте в течение 24 часов. Соберите трансфецированные клетки с помощью трипсина; высейте клетки с плотностью 60–70% в шестилуночные планшеты и оставьте их в инкубаторе на ночь. Аспирируйте среду с трансфецированных клеток.

Затем добавьте 1 мл буфера для теплового шока и инкубируйте в течение 30 минут. Чтобы остановить синтез белков de novo, загерметизируйте крышки парафиновыми полосками и инкубируйте на водяной бане при 45 °C в течение 30 минут. После этого снимите парафин и верните клетки в инкубатор для восстановления в указанные временные точки.

Соберите клетки и однократно промойте их в PBS. Для эффективного лизиса клеток подвергните осадок клеток мгновенному замораживанию в жидком азоте, затем добавьте 200 µL разведенного пассивного буфера для лизиса. Теперь разнесите по лункам в трех повторностях: по 30 µL клеточного лизата на каждую лунку планшета на 96 лунок.

Для оценки эффективности трансфекции начните с контрольных образцов без шоковой обработки. Для измерения активности люциферазы подготовьте свежий реакционный буфер 0,2 мМ Lucifer в глицин-буфере, содержащий 1 мМ ATP и 0,2 мкМ ezine reaction buffer. Поместите 96-луночный планшет в люминометр и запустите программу.

Рабочая станция Wallach 1420. Поместите насос 1 в пробирку Falcon, содержащую 0.2 µM реакционного буфера ezine. Выберите в меню опцию «Обслуживание диспенсера» (dispenser maintenance) и отметьте насос 1.

Выберите опцию «заполнить», чтобы отредактировать схему планшета. Выберите вариант, изучите протокол и результаты в меню. Выберите протокол.

Теперь выберите лунки для считывания. Вернитесь в менеджер Wallach и нажмите «старт» (start), чтобы измерить эмиссию образцов. При 482 нанометрах перейдите в раздел обслуживания дозатора (dispenser maintenance), выберите «опустошить и прокачать один раз» (empty and pump one), чтобы вернуть весь остаток раствора в пробирку.

Теперь переместите трубку в пробирку Falcon с водой и нажмите «tick» (галочка), чтобы промыть систему. Затем выберите «empty» (опорожнить). После этого поместите трубку от первого насоса в реакционный буфер, а трубку от второго насоса — в раствор LUCIFERIAN.

Измените схему планшета. Выберите заполнение для первого и второго насосов. В меню обслуживания диспенсера выберите протокол и начните измерение длины волны реакции люциферазы светляка 560 нанометров.

По окончании повторений повторите процедуру: опорожнение, промывка, опорожнение. Для насоса один и насоса два просмотрите результаты в Wallach 1420 Explorer. Каждый эксперимент связан с определенным анализом.

Введите имя пользователя, дату начала и дату окончания, затем экспортируйте результаты в файл Excel. Для анализа следует учитывать, что рефолдинг белка напрямую зависит от времени восстановления. В данном эксперименте состояние клеток оценивается в разные моменты времени после теплового шока.

В отсутствие и в присутствии молекулярного шаперона. Как и ожидалось, процент рефолдинга люциферазы увеличивается с увеличением времени восстановления как в контрольных группах, так и в клетках, трансфицированных молекулярным шапероном. Напротив, некорректный набор данных характеризуется низкими значениями коэффициента детерминации R squared при корреляции между временем и рефолдингом.

После применения данного метода можно использовать другие подходы, такие как анализ TPA in vitro, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, о подавлении ферментативной активности шаперона. После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое понимание того, как измерять уровень внутриклеточного белка после теплового шока.