Обнаружение и изоляция циркулирующих клеток меланомы использованием Фотоакустическая флоуметрии

Целью данного эксперимента является обнаружение рака до образования вторичных опухолей. Для этого сначала получают и разделяют образцы крови пациентов с меланомой четвертой стадии. На втором этапе кровь вводится в фотоакустическую проточную камеру, которая позволяет обнаруживать и изолировать клетки меланомы.

Затем полученные изображения захваченных клеток используются для подтверждения наличия обнаруженной меланомы. Результаты демонстрируют способность системы точно и быстро обнаруживать и изолировать клетки меланомы на основе форм фотоакустических волн и методов визуализации клеток. Основным преимуществом нашего метода по сравнению с существующими способами обнаружения циркулирующих клеток меланомы, такими как R-T-P-C-R, биомагнитная сортировка клеток и другие методы, является то, что наш метод не требует маркировки и позволяет захватывать циркулирующие клетки меланомы без изменения их поверхности или закрепления на подложке.

Для подготовки образца для обнаружения метастатического рака начните с забора приблизительно 10 мл цельной крови у пациента с четвертой стадией рака. Центрифугируйте кровь в двух вакутайнерах объемом 5 мл в течение 10 минут. При 3000 об/мин образец крови разделится на три различных слоя. Нижний слой состоит из эритроцитов.

Средний слой, также называемый лейкоцитарным слоем (buffy coat), содержит лейкоциты и клетки меланомы, а верхний слой состоит из плазмы и тромбоцитов. Удалите как можно больше плазмы, стараясь не задеть лейкоцитарный слой. Добавьте 250 µL раствора OptiPrep 10% в пробирки объемом 2 мл.

С помощью девятидюймовой пастельной пипетки извлеките оставшуюся плазму, весь лейкоцитарный слой (buffy coat) и верхний слой эритроцитов. Убедитесь, что объем собранного раствора составляет менее 500 µL. Перенесите раствор в предварительно подготовленные пробирки wind Trobe.

Кровь снова разделится, но на этот раз эритроциты будут отделены слоем плазмы, что позволит легко извлечь лейкоцитарный слой (Buffy coat). Используйте девятидюймовую пипетку Пастера, чтобы изолировать весь лейкоцитарный слой и поместить его в пробирку типа Eppendorf объемом 2 мл. Затем суспендируйте его в 1,5 мл PBS с 2% v/v бета-меркаптоэтанола.

Для изготовления проточной камеры возьмите акриловый цилиндр длиной 8 мм, с внешним диаметром 20 мм и внутренним диаметром 17 мм. Затем просверлите в боковой стенке цилиндра три отверстия диаметром 5 мм под углом 90 градусов друг к другу. После этого отрежьте три фрагмента полимерной трубки и вставьте их в просверленные отверстия.

Натяните парафильм на дно акрилового кольца, чтобы обеспечить герметичность. Парафильм вместе с акриловым кольцом образует неглубокую чашу, в которой будет находиться раствор акриламида для создания проточной камеры. Проденьте проволоку диаметром 1.6 millimeter через два фрагмента трубки, расположенных друг напротив друга, следя за тем, чтобы через центр кольца в третьем фрагменте трубки была видна только проволока.

Вставьте проволоку диаметром 1.6 millimeter и расположите трубку на расстоянии one millimeter от подвешенной проволоки. Эти проволоки предотвращают попадание акриламида в трубку. Приготовьте five milliliters акриламида.

Затем быстро перелейте смесь в акриловое кольцо, заполняя его доверху. Через несколько секунд раствор превратится в гель. Чтобы создать форму камеры потока, осторожно извлеките проволоки, стараясь не повредить акриламидный гель; в результате образуется цилиндрический канал потока и место для размещения оптического волокна, сфокусированного на этом канале.

Проточная кювета готова к использованию с применением ультразвукового геля для обеспечения акустического контакта. Присоедините пьезоэлектрический акустический преобразователь из поливинилиденфторида к проточной кювете непосредственно над путем потока. С помощью байонетного разъема или кабеля BNC подключите преобразователь к входу широкополосного приемника.

Подключите выход фильтра к осциллографу для синхронизации запуска прибора. Установите фотодиод рядом с преобразователем и подключите его к осциллографу с помощью кабеля B NNC. Вытяните трубку проточной кюветы до образования небольшого воздушного кармана и соедините её с преобразователем.

Затем вставьте оптическое волокно и заполните кювету водой, чтобы уменьшить интерфейсные сигналы и увеличить количество лазерного излучения, поступающего на путь потока. Благодаря числовой апертуре оптического волокна и малому расстоянию до пути потока лазер в любой момент времени будет облучать только одну порцию образца, что гарантирует, что образец непосредственно перед лазером является тем же самым образцом, который создает фотоакустические сигналы.

Затем прикрепите Т-образный соединитель к одному патрубку проточной кюветы, а к остальным ответвлениям соединителя подключите два шприцевых насоса. В одном шприце должен находиться воздух, а в другом — ранее подготовленная суспензия клеток. После этого запустите оба шприцевых насоса.

Когда две совместимые жидкости достигают Т-образного соединения, они разделяются на гомогенные сегменты и протекают мимо преобразователя. Облучите протекающий образец наносекундным импульсным лазером для генерации фотоакустических волн в клетках меланомы. Поскольку меланин является широкополосным оптическим поглотителем, может быть использована любая длина волны лазера в видимом диапазоне.

Появление сигнала на осциллографе, когда слизень находится над преобразователем, указывает на наличие в нем меланомы. Отслеживайте его перемещение по системе перед тем, как сбросить его в пробирку для сбора. Для подготовки образцов к иммуноцитохимическому анализу поместите предметные стекла в цитоцентрифужные воронки и установите их в цитоцентрифугу; центрифугирование поможет захваченным клеткам закрепиться на предметных стеклах.

Поместите по 100 µL 1%BSA в PBS в каждую воронку. Затем центрифугируйте при 600 RPM в течение трех минут. После центрифугирования добавьте образцы клеток в воронки для CyTOF, затем снова центрифугируйте при 600 RPM в течение трех минут.

Обработайте стекла спреем-фиксатором на основе этанола. Затем дважды промойте стекла в PBS по 10 минут для блокирования неспецифического связывания. Инкубируйте каждое стекло со смесью 10 µL сыворотки козы и 90 µL PBS в течение одного часа при комнатной температуре.

После инкубации слейте раствор со стекол и добавьте раствор первичных антител. Каждое стекло должно содержать 1% rabbit mark, одно 1% mouse CD 45 и 10% goat serum в PBS; инкубируйте в течение одного часа в увлажненной камере при комнатной температуре. Затем трижды промойте стекла в PBS по 10 минут.

Затем инкубируйте стекла с соответствующими флуоресцентными вторичными антителами в темноте в течение одного часа при комнатной температуре, после чего слейте раствор. Затем промойте их в PBS трижды по пять минут; для окрашивания ядер инкубируйте клетки с 0.1 µg/mL DPI в течение одной минуты. После этого слейте раствор и промойте стекла в PBS.

Наконец, используя смоляную среду для заключения, накройте образец клеток покровным стеклом, загерметизируйте его бесцветным лаком для ногтей и проведите визуализацию с помощью флуоресцентного микроскопа. Формы фотоакустических волн от лейкоцитов и клеток меланомы показаны здесь слева. Лейкоциты, не имеющие собственной пигментации, не генерируют фотоакустических волн и проявляются в виде плоской линии электронного шума справа.

Тем не менее, пигментированные клетки меланомы генерируют интенсивную фотоакустическую волну. После иммуноцитохимического окрашивания культивируемые клетки меланомы демонстрируют пятнистые сигналы синего цвета; одна из помеченных клеток выделена зеленым цветом на наложенных изображениях для DPI и одна с CD 45 в качестве индикатора лейкоцитов. На данном рисунке представлены клетки меланомы среди нескольких лейкоцитов после их развития.

Наша методика откроет исследователям в области диагностики рака путь к изучению феномена метастазирования, что позволит улучшить методы обнаружения опухолей и, в конечном итоге, найти способ остановить их фатальное распространение.