Мониторинг белка адсорбция с помощью полупроводниковых нанопор

Общая цель этой процедуры заключается в создании нанопор в искусственных мембранах для использования в исследованиях абсорбции белка. Это достигается путем сверления нанопор в нитридной мембране с помощью стержня. Затем нанопору загружают в камеру и смачивают ее ионным раствором.

Таким образом, жидкость образует мост от одной стороны нанопоры к другой, чтобы сделать нанопору готовой к экспериментам. На него подается напряжение, и можно наблюдать, как через него проходит ток ионов. Заключительным этапом является добавление белка в камеру Nanopore.

В конечном счете, наблюдение долгоживущих блокад ионного тока через нанопор обнаруживает поглощение белков по бокам нанопоры. Привет, меня зовут Дэйв Вики. Я учусь в аспирантуре физического факультета Сиракузского университета.

Тем не менее, этот метод может дать представление об абсорбции белков на неорганических поверхностях. Он также может быть применен к другим системам, таким как белки, взаимодействия нуклеиновых кислот, одиночные молекулы для спектроскопии и изучение молекул в замкнутых пространствах. Начните с поднятия штока до напряжения ускорения.

Следующая загрузка оконной сетки из нитрида кремния SPI в держатель образца ПЭМ. Очистите решетку кислородной плазмой в течение 30 секунд, чтобы очистить ее от мусора. Перед загрузкой образца загрузите держатель образца в TEM и дайте вакууму откачаться вниз.

Используя режим светлого поля TEM, находим окно из нитрида, яркий квадрат на необработанной рограмме. Убедитесь, что TEM выровнен правильно. Затем выровняйте и сфокусируйте образец.

Теперь переведите систему в режим STEM и используйте детектор горячего отключения для получения изображения образца и проверки его выравнивания. Установите монохроматор, если он присутствует, на низкое значение, что позволяет получить более высокий ток электронов, доступных для бурения. Выберите подходящий размер пятна для сверления нанопоры в зависимости от диаметра электронного зонда.

С выровненной ножкой. Используйте BROGRAM, чтобы идеально сфокусироваться на нитридной мембране при необходимом увеличении. Если есть какое-либо движение образца, болванку электронного пучка и дождитесь стабилизации образца.

Это может занять до часа. После стабилизации поместите электронный зонд на образец и начните сверление нанопоры. Сверление нанопор с помощью ТМ требует неверности пациента.

Это процесс, в котором нитрид постепенно рассеивается под электронным зондом. Важно держать электронный зонд прямо над местом сверления и убедиться, что нанопоры полностью просверлены. Перед извлечением образца из ПЭМ периодически проверяйте образец, сканируя его с помощью детектора горячего отключения.

Если образец немного дрейфует, отрегулируйте положение электронного зонда так, чтобы он находился над нанопорой. Когда в фокусе находится грамм ROI, мерцающая нитридная пленка исчезнет. Когда нанопоры образуются с расфокусированным граммом, видна изношенная бахрома ногтя.

Сфотографируйте нанопоры с выключенным режимом и создайте профиль интенсивности изображения. Диаметр нанопор можно оценить по самой темной области профиля. Электронный зонд может быть использован для увеличения нанопоры, если это необходимо.

Когда он имеет необходимый диаметр. Переключитесь в режим ПЭМ с монохроматором в штатной настройке. Используйте светлопольный ПЭМ для подтверждения размера пор.

Начните с приготовления degas di saline. Поставьте раствор под вакуум и в ванне прососните ультразвуком в течение 20 минут Деликатно поместите хрупкую нанопору, содержащую чип нитрида кремния, в клюв Pyrex объемом 10 миллилитров. Затем в вытяжной шкаф поместите стакан на горячую плиту.

Очень тщательно очистите чип Nanopore раствором пираньи. Сначала добавьте в емкость три миллилитра серной кислоты с помощью стеклянной пипетки. Во-вторых, осторожно добавьте в серную кислоту один миллилитр перекиси водорода с высоким содержанием водорода.

Пожалуйста, примите все меры предосторожности. Дайте нанопористому чипу впитаться в течение 10 минут. Затем с помощью стеклянной пипетки извлеките раствор пираньи из стакана и утилизируйте его должным образом.

Далее наполните стакан деионизированной водой Дега. С помощью чистой стеклянной пипетки опорожните стакан от воды и повторите это мытье не менее пяти раз. Чистым пинцетом удалите нанопористый чип и высушите его легким всасыванием.

После высыхания немедленно запечатайте нанопористый чип в камере. Чип может быть закреплен в камере с помощью уплотнительных колец или силиконового герметика. Заполните камеру раствором хлористого калия.

Подключите к камере электроды из серебра, хлорида серебра. Электроды могут быть изготовлены путем замачивания серебряной проволоки в отбеливателе на ночь. Подайте трансмембранный потенциал на электроды и контролируйте реакцию тока с помощью усилителя-патч-клещи.

В режиме клещей напряжения постройте кривую напряжения тока на основе измерений. Кривая должна быть очень линейной. При использовании одного моляра хлорида калия проводимость нанопор должна соответствовать его диаметру.

Если нанопора не отображает линейную кривую внутривенного введения, проводимость слишком низкая или открытый ток нанопор нестабилен. Это указывает на то, что нанопоры не закреплены должным образом, и промывание пиха следует повторить. Очень важно убедиться, что жидкость находится внутри нанопор.

Если этот шаг не выполнен должным образом, ионный ток через нанопору будет проявлять очень большой шум, и распределение белков в нанопорах будет резко снижено. Начните с добавления очищенного образца интересующего белка в заземленную ванну камеры. Подождите, пока образец полностью рассеется.

Примените трансмембранное смещение потенциального напряжения с полярностью, противоположной полярности полного заряда изучаемого белка. Приложенный потенциал в 200 милливольт должен быть достаточно большим для наблюдения. Большинство событий белковых аналитов будут проявляться в виде временных отклонений тока от исходного уровня.

Если сигнала не наблюдается, увеличьте концентрацию белка в камере. Более высокие напряжения улучшают соотношение сигнал/шум и нитрид. Нанопоры выдерживают несколько вольт.

Поглощение белка будет проявляться как долгоживущие изменения в базовом токе нанопоры. Типичные результаты для твердотельных нанопор будут следующими. Ток открытых пор должен быть очень стабильным.

Внутривенные характеристики нанопор должны быть высоколинейными. В одном моляре хлорида калия, 10 молярном фосфате калия pH 7,4, наклон линейной подгонки к IV кривой обеспечит унитарную проводимость нанопоры. Проводимость имеет прямую связь с диаметром нанопор и должна соответствовать уравнению.

Это значение должно соответствовать в пределах 30%Если значение слишком малое, поры, скорее всего, не связаны с добавлением белка. Быстрые события должны повлечь за собой абсорбцию белка в виде долгоживущего текущего падения. Некоторые белки очень лабилильны и претерпевают структурную трансформацию внутри пор.

В этом случае долгоживущее падение напряжения будет сопровождаться быстрыми колебаниями. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как производить твердотельные нанопоры с помощью сканирующего просвечивающего электронного микроскопа, а также с использованием уравновешенного поглощения белка SA. Не забывайте, что работа с раствором пираньи может быть чрезвычайно опасной и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как работа в вытяжном шкафу в перчатках, лабораторном халате и фартуке для химикатов.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.