Трансплантация стволовых клеток в В пробирке Имитация ишемии / реперфузии модели

Клетки сердечного происхождения помещают в планшеты для культивирования клеток для имитации ишемии. Модель ишемии-реперфузии реализуется путем выдерживания клеток в течение 150 минут в среде без глюкозы при уровне кислорода ниже 0,5%. Этот период ишемии приводит к сморщиванию и образованию пузырьков (блеббингу) у большинства клеток. Затем снова вводят нормальную среду и восстанавливают уровень кислорода для имитации реперфузии.

Мезенхимальные стволовые клетки добавляют и культивируют совместно с поврежденными клетками. После 24 часов совместного культивирования клетки окрашивают кальцием и этидиум гомодимером. Для дифференциации живых и мертвых клеток используют конфокальный микроскоп, который четко демонстрирует две популяции клеток и их взаимодействия. Анализ методом проточной цитометрии выявляет три кластера поврежденных клеток, которые можно отобразить на графике и проанализировать статистически. Протоколы трансплантации стволовых клеток внедряются в клиническую практику; основные направления современных исследований сосредоточены на улучшении результатов, повышении надежности протоколов и поиске новых источников имплантируемых клеток.

Исследование эффективности клеточной терапии является сложной задачей, и для изучения механизмов, участвующих в процессе лечения, требуются новые инструменты. Мы разработали экспериментальный протокол, позволяющий наблюдать за клеточными связями и даже субклеточными механизмами во время ишемии, реперфузионного повреждения и после трансплантации стволовых клеток. Критерием нашей разработки стала полностью система in vitro, в которой присутствуют только клетки реципиента и донора.

Таким образом, она изолирована от окружающей ткани. Непрерывное измерение жизнеспособности клеток до, во время и после повреждения на протяжении до 24 часов. А также четкая идентификация обеих популяций клеток, что позволяет проследить судьбу трансплантированных клеток.

Для достижения этой цели мы разработали протокол депривации кислорода и глюкозы, часто обозначаемый как OGD, с последующим периодом реоксигенации. В качестве хозяйских клеток мы выбрали клетки C2 линии кардиомиобластов крысы в возрасте девяти дней. После OGD поврежденные клетки поддерживались путем трансплантации мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, которые добавлялись в культуру.

Данная установка позволила нам исследовать межклеточные связи с помощью конфокальной микроскопии и количественно оценить выживаемость поврежденных клеток методом проточной цитометрии. Приступим к работе и разберем, как это делается. Удалите культуральную среду из клеток H nine C two.

Дважды промойте клетки PBS и перенесите чашки Петри в инкубатор, добавив 0,05% трипсин-ЭДТА для переваривания на пять минут. В инкубаторе при температуре 37 °C инактивируйте трипсин, добавив культуральную среду DMEM. Центрифугируйте клетки при 1200 об/мин в течение восьми минут.

После удаления супернатанта ресуспендируйте клетки в 1 мл культуральной среды DMEM, подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра, используя окрашивание трипановым синим. Разместите по 30 000 клеток H9C2 в лунку 12-луночного планшета, затем поместите планшет в инкубатор с CO₂ при 37 °C на 24 часа. Удалите среду путем аспирации и дважды промойте клетки PBS.

Добавьте 3 мм среды без глюкозы. Поместите планшет в систему инкубации клеток. Подайте газообразный азот, чтобы удалить кислород из системы инкубации.

Дождитесь, пока уровень кислорода достигнет 0.5%. Затем запустите таймер; уровень кислорода 0.5% соответствует парциальному давлению примерно в три миллиметра ртутного столба. Подвергните клетки воздействию симулированной ишемии в течение 150 минут. Во время ишемии клетки начинают отделяться от поверхности, а их мембраны — вздуваться. Было установлено, что каждой популяции требуется несколько различное время воздействия для достижения 60–80% повреждения клеток.

Поэтому мы рекомендуем начать с двух фаз реоксигенации (R). Если этого окажется недостаточно, увеличьте время кислородно-глюкозной депривации (OGD). В нашем случае клеткам C2 в возрасте девяти дней обычно требуется от 150 до 170 минут OGD в конце симуляции ишемии.

Удалите безглюкозную среду из лунок с клетками и пипеткой внесите в них обычную культуральную среду. Поместите 12-луночный планшет на 30 минут в инкубатор с содержанием CO₂ при температуре 37 °C. Этот период представляет собой фазу реперфузии.

Во время симуляции ишемии подготовьте спасательные клетки для трансплантации. Разведите флуоресцентный краситель DiD в культуральной среде DMEM в соотношении 1:200. Отсосите среду из флаконов со спасательными клетками и добавьте 300 мкл DMEM с DiD; инкубируйте в чашках Петри в течение 30 минут в CO₂-инкубаторе при 37 °C.

Через 30 минут после завершения реперфузии добавьте по тысяче мезенхимальных стволовых клеток в каждую лунку к посткишемическим кардиомиобластам H9c2. Начальные этапы совпадают с процедурой посева H9c2: двукратная промывка PBS, обработка трипсином и подсчет. Поместите совместную культуру клеток в инкубатор с CO₂ при температуре 37 °C на 24 часа.

Через 24 часа соберите культуральную среду и адгезивные клетки из лунок с помощью пипетирования. Очень важно собрать также культуральную среду, так как некоторые погибшие клетки могли отсоединиться от поверхности культурального планшета в течение 24-часовой инкубации.

Суспендируйте клетки в 500 мкл раствора Live/Dead, 5 мМ Ca²⁺ и 400 нМ Ethidium homodimer в PBS при концентрации 5 × 10⁴ клеток/мл. В случае совместных культур мезенхимальные стволовые клетки отличают от клеток H9C2 по соответствующей флуоресцентной метке. Таким образом становится возможным обнаружение слияния клеток и участков межклеточного контакта.

Долю погибших клеток можно оценить в четырех независимых полях зрения, используя объектив с 10-кратным увеличением для каждой культуры в слепом методе, что обеспечивает воспроизводимый результат подсчета клеток. Перенесите клетки в пробирки для проточной цитометрии. Запустите программное обеспечение Cell Quest Pro для настройки проточного цитометра перед проведением измерений.

Подготовьте контрольные образцы живых и мертвых клеток. Живые клетки культивируют при той же плотности в нормальных условиях и окрашивают на кальций. Мертвые клетки подготавливают путем воздействия в течение одного часа 10 micromole перекиси водорода, окрашивают Ethereum homodimer и собирают тем же способом. Настройки прибора должны быть отрегулированы таким образом, чтобы живые клетки были положительными по кальцию и отрицательными по Ethereum homodimer.

В то время как погибшие клетки являются отрицательными по кальцию и положительными по Ethereum homodimer, процент данных популяций может быть представлен в виде столбцов на графике, а на основе этих значений может быть проведен статистический анализ. Мы обнаружили, что добавление здоровых стволовых клеток увеличивает долю выживших клеток в популяции. Интересно, что мы также заметили: клетки, которые были спасены после повреждения, можно выделить в отдельный гейт не только относительно погибших, но и относительно тех, что оставались живыми.

Мы полагаем, что данная популяция заслуживает дальнейшего изучения. После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как стандартизированным образом проводить эксперименты по симуляции ишемии с трансплантацией стволовых клеток in vitro. На этом всё.

Благодарим за просмотр и желаем удачи в ваших экспериментах. Если у вас возникнут технические вопросы, не стесняйтесь обращаться к нам. Мы будем рады помочь.