Метаболический Подтверждение пути и Discovery Через ¹³ C-маркировки протеиногенных Аминокислоты

Целью данного протокола является изучение бактериального метаболизма с помощью анализа метаболизма с использованием изотопа углерода 13. Сначала микроорганизмы выращивают в присутствии меченных углеродных субстратов, которые встраиваются в микробные белки. Затем микроорганизмы собирают, после чего проводят экстракцию, гидролиз и дериватизацию аминокислот.

Образцы вводят в газовый хроматограф-масс-спектрометр (ГХ-МС). Прослеживая пути перехода атомов между метаболитами в биохимической сети, можно определить функциональные метаболические пути, используемые микробом. Я — Берт Бурла.

Представленный здесь метод может быть использован в качестве дополнения к транскриптомике и протеомике для определения метаболических путей у микробов. Мы применяли эту технику для исследования фотосинтезирующих микробов, таких как цианобактерии, на предмет миотрофного или гетеротрофного использования углерода. В данном видео в качестве модельного штамма будет использован ANOTHE 5 1 1 42, чтобы продемонстрировать применение меченных углеродных субстратов для поиска новых ферментативных функций.

Процедуру продемонстрируем я, li Yu и Chu Yang Fang. Начните выполнение данной процедуры с культивирования бактерий cyana thesei в немаркированной среде. Когда бактерии достигнут средней логарифмической фазы роста, инокулируйте их в среду, маркированную углеродом 13, в объеме 3%.

Затем, чтобы избежать попадания немаркированного углерода из исходного субкультурального инокулята в ту же маркированную среду в середине логарифмической фазы роста, при достижении бактериями Cy Thesei, маркированными углеродом 13, середины логарифмической фазы роста, соберите 10 мл культуры путем центрифугирования. Ресуспендируйте осадок в 1,5 мл 6 M соляной кислоты и перенесите его в прозрачный стеклянный виал с завинчивающейся крышкой для газовой хроматографии (ГХ).

Закройте флаконы крышками и поместите их в печь при температуре 100 °C на 24 часа для гидролиза белков биомассы до аминокислот. Гидролиз гранул биомассы позволяет получить 16 из 20 распространенных аминокислот. После гидролиза перенесите раствор аминокислот в микроцентрифужные пробирки объемом 2 мл, затем центрифугируйте при 20 000 ×g в течение пяти минут для осаждения твердых частиц.

После центрифугирования перенесите супернатанты в новые виалы для ГХ, чтобы удалить твердые частицы из раствора гидролиза и предотвратить их попадание в колонку ГХ. Затем аминокислоты подвергают дериватизации для придания им летучести, необходимой для разделения методом газовой хроматографии. Растворите высушенные образцы в 150 µL тетрагидрофурана (THF) и 150 µL N,O-бис(триметилсилил)трифторацетамида (BSTFA).

Добавьте реагент для дериватизации ацетамид, T-B-D-M-S, и инкубируйте все образцы в термостате при температуре от 65 до 80 °C в течение одного часа. Периодически перемешивайте образцы на вортексе, чтобы обеспечить полное растворение метаболитов в виале. Центрифугируйте образцы при 20 000 ×g в течение 10 минут, после чего перенесите супернатант в новые виалы для ГХ.

Надсеточный раствор должен представлять собой прозрачный желтоватый раствор. Температурный режим ГХ следующий: выдержка при 150 °C в течение двух минут. Повышение температуры со скоростью 3 °C в минуту до 280 °C.

Повышайте температуру со скоростью 20 °C в минуту до 300 °C, затем выдерживайте в течение пяти минут. Затем для ГХ-колонки длиной 30 м установите задержку выхода растворителя примерно на пять минут, а диапазон отношения массы к заряду — от 60 до 500. Проанализируйте образцы методом ГХ-МС, используя объем ввода 1 µL с коэффициентом деления потока от 1:5 до 1:10 и поток газа-носителя гелия 1,2 mL/min в соответствии с программой анализа.

Проанализируйте данные ГХ-МС с помощью Microsoft Excel. Время удерживания на ГХ и уникальные пики отношения массы к заряду для каждой аминокислоты представлены на этом рисунке. T-B-D-M-S-производные аминокислоты обычно четко разделяются методом МС на два заряженных фрагмента: фрагмент M минус 57, который содержит всю аминокислоту, и фрагмент M минус 159, в котором отсутствует альфа-карбоксильная группа аминокислоты для лейцина и изолейцина.

Пик M минус 57 перекрывался другими пиками фрагментов масс. N минус 15 может быть использован для анализа всего мечения аминокислот. Кроме того, группа F 3 0 2 часто обнаруживается в большинстве аминокислот и содержит только первую альфа-карбоксильную группу и вторые атомы углерода в скелете аминокислоты.

Однако, поскольку этот пик Ms.Peak часто характеризуется высоким отношением шума к сигналу, использование F 3 0 2 не рекомендуется для количественного анализа метаболических потоков. Дериватизация аминокислот или центральных метаболитов приводит к внесению значительного количества природных изотопов, включая carbon 13, oxygen 18, silicon 29 и silicon 30. Шум измерений, вызванный природными изотопами в исходном масс-спектре или изотопном профиле, может быть скорректирован с помощью опубликованного программного обеспечения.

Окончательные данные по изотопному мечению представлены в виде массовых долей. Например, M0, M1, M2, M3 и M4 представляют фрагменты, содержащие от нуля до четырех атомов углерода, меченных изотопом углерода 13. Данный штамм 5 1 1 2 не содержит фермент триптофан-аммиак-лиазу, который катализирует превращение триптофана в 2-кетобутират в типичном пути синтеза илеюцина.

Следовательно, чтобы определить путь синтеза изолейцина у этого организма, штамм Cyana Thesei 5 1 1 42 выращивали на среде ASP two с 54 мМ глицерина и анализировали методом GCMS, как описано в данном видео. Как показано здесь, Cyana Thesei 5 1 1 4 2 использует глицерин с меткой во втором положении в качестве основного источника углерода; мы заметили, что треонин и аланин, предшественником которых является пируват, имеют один меченый атом углерода, в то время как изолейцин был мечен тремя атомами углерода. Таким образом, синтез у Cyana Thesei 5 1 1 4 2 не может осуществляться через треониновый путь, используемый большинством организмов. С другой стороны, лейцин и изолейцин имеют идентичные паттерны мечения, основанные на фрагментах M-15 и M-159.

Например, изотопные данные для 15N, содержащего нефрагментированные аминокислоты, показали идентичное мечение для лейцина и изолейцина. Таким образом, лейцин и изолейцин должны синтезироваться из одних и тех же предшественников — пирувата и ацетил-CoA. Это наблюдение согласуется с переходом меченого углерода в цитрат-малатном пути синтеза изолейцина.

Данный метод может быть использован для изучения метаболизма широкого спектра микроорганизмов и, при наличии соответствующего навыка, может быть выполнен от начала до конца примерно за одну неделю.