Применение MassSQUIRM для количественного измерения Лизин активность деметилазы
11 марта 2012 г.
Мы представляем способ использования MALDI масс-спектрометрии и восстановительной химии метилирования количественного изменения в лизин метилирования.
Протокол массового извиления направлен на количественную оценку активности лизиндеметилазы с использованием изотопного метилирования и масс-спектрометрии MALDI, сначала выполняющих реакции деметилирования, катализируемые ферментами, на пептидах, содержащих метилированный лизин. Затем остатки химически метилируют пептидные продукты реакции деметилазы дейтерированным формальдегидом с получением равномерно метилированных пептидов, которые ионизируются таким же образом с помощью maldi, приступают к количественному определению каждого вида пептида с помощью мульти- и масс-спектрометрии и учитывают изотопное перекрытие. Для того чтобы определить относительные количества монокрасителя и метилированных пептидов тримм, результаты измерения массы определяют относительные количества каждого продукта реакции деметилазы на основе изменений в массе.
Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как обычная масс-спектрометрия с плесенью, заключается в том, что масс-оценка учитывает различия в ионизации между различными метилированными пептидами. Впервые идея этого подхода пришла нам в голову, когда мы разработали метод измерения уровней ацетилирования гистонов с использованием изотопно тяжелого уксусного ангидрида. Сложность этого метода заключается в извлечении данных о пиковых площадях, что может быть осложнено перекрытием пептидных изотопных оболочек.
Для деметилазной реакции соединили 125 нанограммов рекомбинантной лизин-специфической деметилазы с 0,25 микрограммами биотинилированного диметилгизона Н трех пептидов в конечном объеме 20 микролитров деметилазного буфера. Также подготовьте контрольный образец, содержащий 0,25 мкг пептида без ЛСД, один фермент, инкубируйте реакцию и контрольные пробирки в течение двух часов при 37 градусах Цельсия. Далее для приготовления двух 20 микронных пористых шариков смешайте равные объемы шариков и метанол.
Затем добавьте 10 объемов муравьиной кислоты TFA, добавьте к каждому образцу восемь микролитров пористых шариков и перемешивайте в течение 15 минут при комнатной температуре. Тем временем подготовьте два наконечника молнии C 18. Двукратное пипетирование с 20 микролитрами 0,1% ТЖК четыре раза с 70% ацетонитрилом 0,1% ТЖК и еще четыре раза с 0,1% ТЖК.
Затем загрузите два образца на кондиционированные наконечники молнии. С помощью пипетки протолкните объем через смолу C 18. Повторяйте до тех пор, пока общий объем обоих образцов не будет протолкнут через кончики молнии.
Затем дважды промойте кончики молний с 20 микролитрами 0,1% TFA elute образцами в иллюзионном буфере объемом 40 микролитров, приступайте к полному высыханию с помощью скоростного пылесоса. Сначала суспендируйте образец в 100 микролитрах 50 миллимолярного фосфатного буфера pH 7,4. Затем добавьте восемь микролитров борцового диметиламина и 16 микролитров дефорсированного формальдегида.
Выдерживать при температуре четыре градуса Цельсия в течение двух часов. Повторите восстановительное метилирование, добавив сверливший диметилламин и дейтерированный формальдегид, и инкубируйте в течение двух часов. В третий раз добавьте сверлящий диметилламин и выдерживайте при температуре четыре градуса Цельсия в течение 15 часов.
Погасите реакцию с помощью 12,5 микролитров одного моляра. pH 7,4 приступайте к полному высыханию с помощью скоростного вакуумного концентратора. Сначала реакцию суспензии контрольной и деметилазной реакции образцов в 100 микролитрах 50 миллимолярного фосфатного буфера pH 7,4.
Теперь добавьте восемь микролитров пористых шариков в контрольные образцы и образцы для реакции деметилазы и соберите на застежках-молниях, как показано ранее. Вытащите в объеме два микролитра на планшет для образцов MALDI и дайте высохнуть при комнатной температуре до кристаллизации. Приступайте к анализу образцов методом масс-спектрометрии.
Откройте файлы спектров в рабочем программном обеспечении и экспортируйте их в программное обеспечение M over Z. Дальнейшая верификация продуктов реакции с помощью тандемной масс-спектрометрии. Во-первых, определите отношение пиковых площадей изотопов углерода 13 C two и углерода 13 C 4 относительно пика моно изотопа для контрольного образца.
Используйте эти рассчитанные соотношения для количественной оценки относительного количества пептида, присутствующего в каждой модификации. Состояние образца деметилазной реакции. Фермент LSD1 может быть эффективно использован в количественном определении деметилирования лизина при массовом извивании.
Поскольку контрольная реакция не подвергается восстановительному метилированию, она указывает на типичную изотопную оболочку для этого пептида. Результирующие пиковые области определяют фоновые соотношения пептида, присутствующего в углероде 13 C two и углероде 13 C 4. Изотопные состояния, пиковые площади масс-спектра для управляющей реакции позволяют количественно оценить относительное количество пептида, присутствующего в каждом модифицированном состоянии. В реакции деметилазы пиковые участки от этих реакций контроля и деметилазы определяют 33,7% диметиллизина 4, 42 0,3% монометиллизина 4 и 24% неметилированного лизина 4.
Этот подход с массовым сквамом позволяет получить ключевые сведения в области эпигенетики гистонов, например, о том, как деметилирование остатков гистонового лизина способствует развитию различных заболеваний. Хотя этот анализ метилирования был применен для изучения деметилаз, он также может быть использован для изучения метилтрансфераз.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен метод количественного определения активности лизин-деметилаз с использованием масс-спектрометрии MALDI и химии восстановительного метилирования. Этот подход позволяет измерять изменения уровней метилирования лизина с помощью изотопного мечения.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биохимия
- Масс-спектрометрия
Теоретические основы
- Метилирование лизина является критически важной посттрансляционной модификацией.
- Понимание активности деметилаз имеет важное значение для эпигенетических исследований.
- Существующие методы могут не учитывать различия в ионизации метилированных пептидов.
- Данное исследование основывается на предыдущих работах по измерению ацетилирования гистонов.
Цель исследования
- Разработать надежный метод количественного определения активности лизин-деметилазы.
- Повысить точность масс-спектрометрии при обнаружении изменений метилирования.
- Изучить динамику метилирования лизина в биологических системах.
Используемые методы
- Реакции деметилирования метилированных лизиновых пептидов, катализируемые ферментами.
- Химическое метилирование продуктов реакции деметилазы дейтерированным формальдегидом.
- Использование MALDI-масс-спектрометрии для количественного анализа.
- Анализ изотопного перекрытия для определения относительного количества пептидов.
Основные результаты
- Успешное количественное определение немодифицированных и метилированных форм пептидов.
- Демонстрация преимуществ данного метода по сравнению с традиционной масс-спектрометрией.
- Выявление проблем, связанных с извлечением данных о площади пиков.
- Валидация подхода с помощью сравнительного анализа.
Выводы
- Данный метод предлагает новый подход к изучению динамики метилирования лизина.
- Он углубляет понимание активности деметилаз в биологическом контексте.
- В дальнейшем этот метод может быть применен в различных областях эпигенетики и протеомики.
Часто задаваемые вопросы
Промышленная значимость
Количественное измерение активности лизин-деметилаз имеет решающее значение для валидации эпигенетических мишеней и идентификации ведущих соединений при разработке лекарственных препаратов. Метод MassSQUIRM устраняет основной недостаток существующих анализов, обеспечивая возможность прямого сравнения состояний метилирования с помощью изотопной стандартизации, что повышает прогностическую достоверность при снижении рисков, связанных с механизмами действия эпигенетических мишеней. Это способствует принятию решений на ранних этапах разработки, предоставляя воспроизводимые количественные данные о взаимодействии с мишенью и модуляции сигнальных путей.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы путем количественного определения активности деметилазы на определенных пептидных субстратах.
- Практическая ценность: Предоставляет стандартизированный метод сравнения неметилированных, моно-, ди- и триметилированных состояний лизина, что снижает механистическую неопределенность при валидации мишени.
- Прогностическая ценность: Способствует приоритизации портфеля препаратов за счет получения количественных данных об активности, которые коррелируют с взаимодействием с мишенью и модуляцией сигнального пути.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: обеспечивает получение равномерно ионизируемых пептидов путем восстановительного метилирования, что позволяет проводить надежное количественное определение методом MALDI-MS независимо от степени метилирования.
- Масштабируемость: совместимость с адаптацией под планшетный формат для проведения скрининга библиотек соединений против мишеней-деметилаз со средней пропускной способностью.
- Воспроизводимость: корректирует различия в ионизации метилированных пептидов, обеспечивая согласованность количественных результатов в разных экспериментах и лабораториях.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает согласованность с системами, релевантными для заболевания, путем количественной оценки активности деметилаз в контексте гистоновых и негистоновых белков.
- Механистическое снижение рисков: позволяет осуществлять лонгитюдный мониторинг модуляции мишени в доклинических моделях за счет количественного определения состояния метилирования.
- Согласованность биомаркеров: облегчает оценку изменений метилирования в качестве потенциальных фармакодинамических биомаркеров в исследованиях по взаимодействию с мишенью.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Метод MassSQUIRM вписывается в континуум ранних этапов поиска лекарственных средств, связывая валидацию мишени с помощью количественного биохимического анализа с идентификацией соединений-лидеров и доклинической оценкой за счет обеспечения масштабируемых и воспроизводимых измерений активности.
- Биологические исследования: Оказывает поддержку при проверке гипотез и уточнении сигнальных путей путем количественного определения фермент-специфической деметилирующей активности на синтетических пептидных субстратах.
- Скрининг: Обеспечивает стандартизацию анализа и получение количественных данных для кампаний по скринингу соединений, нацеленных на лизин-деметилазы.
- Аналитика: Предоставляет соотношения площадей изотопных пиков, которые позволяют напрямую сравнивать состояния модификации, что способствует принятию решений на основе данных при переходе от хитов к лидам.
- Трансляционные исследования: Связывает результаты с доклинической работой, позволяя измерять активность деметилаз в пептидных и белковых субстратах, имеющих значение для конкретных заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: Создает многократно используемую платформу для характеристики эпигенетических мишеней в рамках нескольких проектов и терапевтических областей.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Количественная оценка активности деметилазы, снижение систематической ошибки ионизации при сравнении состояний метилирования и повышение достоверности определения мишени.
- Операционная ценность: Стандартизация ионизации пептидов, воспроизводимость на различных платформах MALDI-MS и возможность масштабирования для высокопроизводительных форматов.
- Стратегическая ценность: Принятие обоснованных решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») на основе количественных данных о модуляции мишени, что снижает биологические риски в эпигенетических программах.
- Влияние на портфель: Приоритизация эпигенетических мишеней с учетом рисков за счет надежного профилирования активности и понимания механизмов действия.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области энзимологии, пептидной химии и интерпретации данных масс-спектрометрии MALDI.
- Зависимость от наличия оборудования для MALDI-MS и реагентов для изотопного восстановительного метилирования (дейтерированный формальдегид, боран-диметиламин).
- Необходимость использования стандартизированных протоколов синтеза пептидов, подготовки ферментативных реакций и обеспечения согласованности изотопного мечения между исследовательскими группами.
- При адаптации метода следует учитывать субстратную специфичность и совместимость с различными пептидными последовательностями, помимо гистона H3.
- Практические ограничения включают сложности при деконволюции площади пиков из-за перекрывания изотопных профилей, что требует тщательного спектрального анализа и использования специализированного программного обеспечения.
