Прижизненное микроскопия Селезенка: Количественный анализ паразитов Мобильность и кровотока

В этой процедуре мы демонстрируем количественный подход прижизненной микроскопии для оценки динамики прохождения паразита через селезенку. В модели малярии у грызунов мышей, инфицированных трансгенными паразитами GFP, готовят к прижизненной микроскопии вен селезенки, канюляция позволит вводить прижизненные красители. В ходе эксперимента флуоресцентные клетки визуально перемещаются в разных областях селезенки.

Мы приводим мифологию для описания подвижности паразита в трехмерном медленном отсеке красной пульпы и расчета кровотока в сосудах. По этим параметрам сравнивали динамику селезенки двух штаммов PULE. Всем привет.

Меня зовут Нандо Эль Портильо, и один из главных исследовательских вопросов в моей лаборатории — попытаться понять роль селезенки в развитии малярии. Спленомегалия является одним из признаков этого заболевания, но из-за технических и этических проблем очень трудно попытаться обратиться к исследованиям этого органа. Для этого мы внедрили технологии, которые позволяют нам видеть динамическое прохождение этого паразита и количественно оценивать это явление.

Это то, что Лорена и MI объяснят в этих протоколах. Это исследование частично проводится в сотрудничестве с группами доктора Лера из Гамбургского университета в Германии и доктора Марии Кбо здесь, в больничной клинике, и получило общее финансирование от обнаруженного фиона Cellex и министерской CIA В Эспаноле инфекция инициируется от донора М, инфицированного либо летальными, либо нелетальными паразитами GFP с 10% паразитами. Чтобы проверить паразита, возьмите небольшую каплю крови из хвостовой вены мыши и разверните ее под микроскопом.

Сдвиньте холе метрическое окрашивание с помощью GIM. Раствор позволит визуализировать инфицированные эритроциты после высыхания, зафиксировать мазок крови метанолом в течение двух минут, нанести раствор GIMs и инкубировать в течение 20 минут. Промойте предметное стекло текущей водой из-под крана и в сухом виде перечислите процентное соотношение ПБК к общему количеству эритроцитов с помощью светового микроскопа с сотней масла. Объективный.

Заражайте мышей летальными или нелетальными паразитами, полученными из хвостовой крови мышей-доноров, разведенной в PBS. Отрегулируйте дозу таким образом, чтобы ввести полмиллиона паразитов на каждую мышь, чтобы достичь уровня периферического паразита в 1% на третий день после заражения, и введите внутрибрюшинный препарат. В качестве альтернативы для контроля можно использовать эритроциты с маркировкой FITC.

Животные собирают один миллилитр артериальной крови у мыши и промывают гранулу центрифугированием в PBS, содержащей ЭДТА, в растворе FITC и инкубируют в течение двух часов в темноте с легким перемешиванием. По истечении этого времени удалите надосадочную жидкость центрифугированием и тщательно промойте. Введите в контрольную мышь в среднем до 1% периферического кровообращения и приступайте к экспериментам in vivo.

Здравствуйте, меня зовут Мия. Чтобы изобразить селезенку in vivo, нам нужно выполнить небольшую синергию животного, чтобы обнажить селезенку, очевидно, с помощью этой техники. Я узнала об этом от Стефани Гр в лаборатории работника Хейслера, которому я хотела бы поблагодарить и теперь покажу вам, как нужно действовать.

Визуализация инфицированного миоза: Проводится на третий день после инфицирования, когда парат составляет 1% в обоих штаммах. Держите мышь под наркозом и при регулируемой температуре на протяжении всей процедуры. Защитите глаза от гидратации и убедитесь, что мышь полностью обезболивается, промотав подушечку ноги перед тем, как продолжить, чтобы облегчить внутривенное введение веществ.

В ходе эксперимента канюляционно продавливайте вену на хвосте мыши, чтобы построить канюлю. Вставьте маленькую иглу в один конец тюбика, а его аппликатор – в другой. Загрузите в канюлю физиологический раствор, удаляющий пузырьки, и проверьте, правильно ли раствор течет через канюлю.

Боковая вена хвоста будет канюлирована начисто. Улучшите его видимость, сделав мягкое сужение у основания хвоста. Введите кончик канюли внутрь вены.

Появление крови будет свидетельствовать о том, что игла расположена правильно. Если его нет, повторите канюляцию вверх по течению вены, после чего зафиксируйте канюлю к хвосту с помощью клея и скотча. Обнажите нижнюю часть селезенки через небольшой разрез на коже и мускулатуре на левой спинной стороне животного.

Поместите селезенку там, где наблюдается меньшее дыхание, и нанесите PBS на открытую поверхность, чтобы сохранить ее чистой от мышиной шерсти и увлажненной. Запечатайте селезенку покровом для сна, чтобы обеспечить визуализацию. Здравствуйте, меня зовут Лорена.

Показанный протокол позволит нам визуализировать движение паразитов PULI по селезенке. Это стало возможным благодаря трансгенным паразитам GFP. Любезно сделайте пожертвование от Джеймса Бернса из Университета Дрекселя.

Визуализация движения флуоресцентных паразитов позволит нам узнать, есть ли разница в поведении между летальными и нелетальными штаммами. Эксперименты с микроскопией Видаля проводились в многофотонном микроскопе Leica, оснащенном инкубационной системой с контролем температуры и объективом с 63-кратным содержанием глицерина. Поместите животное на предметное столико микроскопа покровом для сна селезенкой вниз к объективу. Первоначально.

Визуализация селезенки при меньших увеличениях позволит получить общее представление о микроциркуляционной структуре органа. Фокусируется селезенка с помощью аутофлуоресцентной ткани, наблюдаются паразиты GFP, проходящие через различные участки селезенки. Здравствуйте, меня зовут Мария Альбо из Научно-технологического центра Университета Барселоны, и мы будем делать прижизненную визуализацию селезенки.

Для изучения кровотока и подвижности инфицированных эритроцитов мы будем использовать конфокальный микроскоп, оснащенный резонансным сканированием, позволяющим получать высокоскоростную визуализацию, что очень полезно для предотвращения движения органа. Это спектральный микроскоп, который позволяет выбирать диапазон зрения. Для того, чтобы получить очень быстрое изображение, мы будем делать одновременную регистрацию двух флуоресцеинов, маркировку и отражение.

Выберите различные зоны для визуализации с помощью эритроцитов, отражения, контраста и красителей Видаля, чтобы подтвердить микроциркуляторное русло селезенки. Теперь мы объясним, как измерить подвижность паразита в сосудистом кровотоке с помощью микроскопии Vidal и программного обеспечения Image J, чтобы проследить движение паразита в трехмерной сети красной пульпы. Получение изображений с глубиной до пяти букв Z в режиме высокоскоростного сканирования.

Преобразуйте стеки изображений в цветные фильмы с Z-кодировкой, чтобы облегчить отслеживание отдельных флуоресцентных клеток. Подробная информация представлена в текстовом отслеживании различных частиц с течением времени на глубине на каждом видео с использованием координат X, Y, Z и T, параметры подвижности, такие как направленность, средняя скорость и время пребывания, могут быть рассчитаны и представлены в виде карт распределения, чтобы обеспечить сравнительный анализ между популяциями штаммов. Сосудистый кровоток в селезенке может быть визуализирован путем системной инъекции нескольких флуоресцентных молекул, описанных в таблице поддержки, таких как декстрин.

А с помощью эндогенного отражения эритроцитов контрастное сканирование центральной линии кровотока путем установки сосудов горизонтально в направлении лазерного сканирования и с помощью усиленной линии усреднения. На этих изображениях полосы, полученные в результате перемещения клеток, будут использоваться для расчета кровотока, получения изображений сосудов с различным диаметром и на протяжении сердечного цикла для компенсации колебаний. Селезенка долгое время считалась черным ящиком в исследованиях малярии, и здесь мы разработали подход количественной прижизненной микроскопии, чтобы получить представление о динамике паразитарной инфекции и кровотоке в этом органе, что позволяет нам решать важные биологические вопросы, такие как адгезия инфицированных эритроцитов к селезенке in vivo.

Спасибо и.