Прижизненное микроскопия Селезенка: Количественный анализ паразитов Мобильность и кровотока

В данной процедуре мы демонстрируем метод количественной интравитальной микроскопии для оценки динамики прохождения паразитов через селезенку. В модели малярии у грызунов мыши, инфицированные трансгенными паразитами, экспрессирующими GFP, подготавливают к интравитальной микроскопии; канюляция селезеночной вены позволяет вводить интравитальные красители. В ходе эксперимента проводится визуализация перемещения флуоресцентных клеток в различных областях селезенки.

Мы представляем методологию описания мобильности паразитов в трехмерном медленном компартменте красной пульпы и расчета кровотока в сосудах. Эти параметры были использованы для сравнения динамики селезенки у двух штаммов PULE. Всем привет.

Меня зовут Нандо Эль Портильо, и один из основных исследовательских вопросов в моей лаборатории заключается в попытке понять роль селезенки при малярии. Спленомегалия является одним из характерных признаков этого заболевания, однако из-за технических и этических проблем проведение исследований этого органа крайне затруднительно. Для решения этой задачи мы внедрили технологии, которые позволяют нам наблюдать за динамикой перемещения этого паразита и количественно оценивать данные явления.

Это то, что Лорена и MI объяснят в данных протоколах. Данное исследование частично проводится в сотрудничестве с группами доктора Лер из Гамбургского университета в Германии и доктора Марии Кбо здесь, в госпитальной клинике, и финансируется фондом Cellex и министерством CIA In Espanol. Инфекция инициируется у донора M, зараженного летальными или нелетальными паразитами GFP, при уровне паразитемии 10%. Чтобы проверить наличие паразитов, возьмите небольшую каплю крови из хвостовой вены мыши и распределите ее на предметном стекле для микроскопии.

Приготовьте мазок крови для окрашивания с помощью GIMs. Данный раствор позволит визуализировать инфицированные эритроциты после высушивания; зафиксируйте мазок крови метанолом в течение двух минут, нанесите раствор GIMs и инкубируйте в течение 20 минут. Промойте предметное стекло проточной водопроводной водой и высушите; подсчитайте процент инфицированных эритроцитов по отношению к общему количеству эритроцитов с помощью светового микроскопа с использованием иммерсионного объектива 100x.

Заразите мышей летальными или нелетальными паразитами, полученными из крови хвоста мышей-доноров и разведенными в PBS. Отрегулируйте дозу так, чтобы ввести по полмиллиона паразитов на одну мышь для достижения уровня периферического паразитемизма 1% на третий день после инфицирования; вводите внутрибрюшинно. В качестве контроля можно использовать эритроциты, меченные FITC.

У мыши собирают один миллилитр артериальной крови, после чего осадок промывают путем центрифугирования в PBS, содержащем EDTA, ресуспендируют в растворе FITC и инкубируют в течение двух часов в темноте при осторожном перемешивании. По истечении этого времени супернатант удаляют центрифугированием и проводят тщательную промывку. Препарат вводят контрольной мыши до достижения среднего содержания 1% в периферическом кровотоке, после чего приступают к экспериментам in vivo.

Здравствуйте, я Мия. Чтобы визуализировать селезенку in vivo, необходимо провести небольшую операцию по доступу к органу, чтобы обнажить селезенку; этой технике я научилась у Стефани ГР в лаборатории профессора Хейслера, которой я хотела бы выразить благодарность. Сейчас я покажу вам, как следует действовать.

Визуализация инфицированного миоза проводилась на третий день после инфицирования, когда уровень парата составлял 1% у обоих штаммов. В течение всей процедуры поддерживайте мышь в состоянии наркоза и при регулируемой температуре. Защищайте глаза от пересыхания и перед началом работы убедитесь, что мышь полностью находится под наркозом, проверив реакцию подушечки лапы на укол, чтобы облегчить внутривенное введение веществ.

В ходе эксперимента выполните канюляцию хвостовой вены мыши для установки канюли. В один конец трубки вставьте тонкую иглу, а в другой — аппликатор. Заполните канюлю физиологическим раствором, удалив пузырьки воздуха, и убедитесь, что раствор свободно проходит через канюлю.

Латеральная вена хвоста будет канюлирована. Для улучшения ее видимости аккуратно пережмите основание хвоста. Введите кончик канюли в вену.

Появление крови будет указывать на правильное положение иглы. Если это не так, повторите канюляцию выше по венозному руслу, затем зафиксируйте канюлю у основания хвоста с помощью клея и пластыря. Обнажите нижнюю часть селезенки, сделав небольшой разрез кожи и мышц с левой дорсальной стороны животного.

Поместите селезенку в область с минимальными дыхательными движениями и нанесите PBS на открытую поверхность, чтобы очистить ее от шерсти мыши и предотвратить высыхание. Закройте селезенку покровным стеклом для обеспечения визуализации. Здравствуйте, меня зовут Лорена.

Представленный протокол позволит визуализировать перемещение паразитов PULI через селезенку. Это стало возможным благодаря использованию трансгенных паразитов GFP. Предоставлено Джеймсом Бёрнсом из Университета Дрекселя.

Визуализация перемещения флуоресцентных паразитов позволит определить, существуют ли различия в поведении между летальными и нелетальными штаммами. Эксперименты по живой микроскопии проводились на мультифотонном микроскопе Leica, оснащенном системой инкубации с контролем температуры и глицериновым объективом 63x. Поместите животное на предметный столик микроскопа так, чтобы селезенка под покровным стеклом была обращена вниз к объективу. Изначально.

Визуализация селезенки при малых увеличениях позволит получить общее представление о микроциркуляторной структуре органа. При фокусировке на селезенке с использованием аутофлуоресценции тканей наблюдаются паразиты, экспрессирующие GFP, которые проходят через различные области селезенки. Здравствуйте, меня зовут Мария Альбо, я представляю Научно-технологический центр Барселонского университета, и мы проведем intravital-визуализацию селезенки.

Для изучения кровотока и подвижности инфицированных эритроцитов мы будем использовать конфокальный микроскоп, оснащенный резонансным сканером, который обеспечивает высокую скорость визуализации, что крайне важно для нивелирования смещения органа. Это спектральный микроскоп, позволяющий выбирать диапазон визуализации. Для обеспечения максимальной скорости съемки мы будем осуществлять одновременную регистрацию двух флуоресцентных меток и отраженного сигнала.

Выберите различные зоны для визуализации с помощью красителей RBC, отражения, контраста и красителя Видаля для выявления микроциркуляторного русла селезенки. Теперь мы объясним, как измерить подвижность паразитов в кровотоке сосудов, используя микроскопию Видаля и программное обеспечение Image J для отслеживания перемещения паразитов в трехмерной сети красной пульпы. Получите изображения на пяти Z-глубинах, используя режим высокоскоростного сканирования.

Преобразуйте стеки изображений в Z-кодированные цветные видеоролики для облегчения отслеживания отдельных флуоресцентных клеток. Подробная информация приведена в тексте: отслеживайте перемещение различных частиц во времени и в глубине на каждом видео с использованием координат X, Y, Z и T. Параметры мобильности, такие как направленность, средняя скорость и время пребывания, могут быть рассчитаны и представлены в виде карт распределения для проведения сравнительного анализа между популяциями штаммов. Сосудистый кровоток в селезенке можно визуализировать путем системного введения нескольких флуоресцентных молекул, таких как декстрин, описанных в сопроводительной таблице.

Затем, используя эндогенный рефлекционный контраст эритроцитов, сканируйте кровоток по центральной линии, расположив сосуды горизонтально в направлении лазерного сканирования и используя улучшенное усреднение по линии (Line average). На этих изображениях полосы, возникающие из-за движения клеток, будут использованы для расчета кровотока; снимайте изображения сосудов разного диаметра и на разных этапах сердечного цикла для компенсации колебаний. Селезенка долгое время считалась «черным ящиком» в исследованиях малярии, и здесь мы разработали количественный подход к интравитальной микроскопии, чтобы получить представление о динамике паразитарной инфекции и кровотока в этом органе, что позволяет нам ответить на важные биологические вопросы, такие как адгезия инфицированных эритроцитов к селезенке in vivo.

Спасибо и.