Построение коллагена Гидрогель для доставки стволовых клеток, загруженных Хитозан микросфер

Этот протокол предлагает стратегию in vitro для доставки стволовых клеток из микросфер хитозана в каркас коллагенового геля, сбора и культивирования. Затем первичные стволовые клетки адипоцитов эмульгируют и восстанавливают препарат микросфер хитозана. Затем засейте стволовые клетки на микросферы хитозана и культивируйте их в мембранной культуральной пластине размером восемь микрон с порами, чтобы получить CSM, загруженный CSM, наконец, смешайте систему доставки микросфер с трехмерным каркасом из коллагенового геля.

В конечном счете, эта система CSM предлагает потенциал для использования в регенеративной медицине и доставке лекарств. Основным преимуществом этой методики перед существующими методами, такими как клеточная инъекция или микрокапсуляция, является способность клеток прикрепляться к материалу-носителю и сохраняться после первоначального применения. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что микросферы эсана имеют врожденный статический заряд.

А загрузка ячеек на слой микросферы будет сложной задачей, не нарушая их. Вырежьте и промойте, промежностную и эпидермальную жировую ткань из обертывания измельчите ткань, затем перелейте один-два грамма в 25 миллилитров HBSS, содержащего 1% FBS. После центрифугирования соберите свободно плавающий слой жировой ткани в колбу Эрленмейера объемом 125 миллилитров

Добавьте 25 миллилитров коллагеназы второго типа и инкубируйте реакцию на орбитальном шейкере. Теперь аккуратно удалите жидкую фракцию ниже масляного и жирового слоя и отфильтруйте последовательно через нейлоновые сетчатые фильтры 170 мкм. Соберите клетки центрифугированием после двух промывок по 25 миллилитров.

HBSS Resus, суспензировать гранулы в 30 миллилитрах добавленной питательной среды mesen pro. Разделите очищенные стволовые клетки, полученные из жировой ткани, в две колбы с культурой T 75 и амплифицируйте препарат A SC в инкубаторе с 5% увлажненным углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия. Этот протокол CSM представляет собой процесс эмульгирования воды в масле, в котором используется метод ионного коэра.

Эмульгируйте шесть миллилитров водного раствора хитозана в 100 миллилитрах смеси масляной фазы с помощью верхнего и магнитного перемешивания одновременно в противоположных направлениях в течение одного часа к устойчивой водно-масляной эмульсии, добавляйте по 1,5 миллилитров 1%-ного гидроксида калия в n восьмеричных количествах каждые 15 минут в течение четырех часов. После завершения ионной реакции сшивания медленно сцедите масляную фазу и сразу же добавьте в сферы до 100 миллилитров ацетона. Промойте сферы ацетоном до полного удаления масляной фазы.

Затем высушите восстановленные шарики в вакууме. При высыхании определяют средний размер частиц CSM, площадь поверхности на миллиграмм и единицу кубического объема с помощью анализатора размера частиц. Приступайте к трехкратному промывке стерильной водой для удаления остатков солей.

Теперь простерилизуйте препарат CSM абсолютным спиртом для использования в клеточных экспериментах в стеклянной пробирке объемом 50 миллилитров, смешайте пять миллиграммов микросфер с одним миллилитром 0,5%-ного раствора TNBS, инкубируйте в течение четырех часов при 40 градусах Цельсия. Затем добавьте три миллилитра шести обычных соляных кислот и выдерживайте при температуре 60 градусов Цельсия в течение двух часов. Охладив образцы до комнатной температуры, добавьте пять миллилитров деионизированной воды и 10 миллилитров эфира Этель.

Для извлечения свободной ТНБ удалите пятимиллилитровую аликвоту водной фазы и нагрейте до 40 градусов Цельсия на водяной бане в течение 15 минут, чтобы испарить остаточный эфир после охлаждения до температуры окружающей среды. Разведите с помощью спектрофотометра на 15 миллилитров воды. Измерьте поглощение подготовленных микросфер хитозана на 345 нанометрах с помощью TNBS в качестве заготовки.

Также измерьте содержание хитозана, используемого для приготовления CSM. Теперь рассчитаем количество свободных аминогрупп в CSM относительно общего числа аминогрупп в хитозане. Уравновесьте пять миллиграммов стерилизованного CSM в стерильном HBSS в течение ночи.

Перенесите CSM на мембранную вставку размером восемь микрон для 24-луночных планшетов для культивирования. После того, как CSM устаканится, осторожно аспирируйте HBSS. Теперь добавьте 300 микролитров питательной среды внутрь вкладыша и 700 микролитров питательной среды наружу вкладыша. Ресус.

Суспендируйте стволовые клетки, полученные из жировой ткани, в 200 микролитрах роста, среды и семян над CSM внутри культуральной пластины. Вставить инкубировать в течение 24 часов в инкубатор, увлажненный углекислым газом с 5% содержанием углекислого газа при температуре 37 градусов Цельсия. Перенесите загруженный SC CSM в стерильную микроцентрифужную пробирку, не повреждая клетки, которые мигрировали в мембрану вставки.

Теперь удалите остатки среды и добавьте в каждую пробирку по 250 микролитров свежей среды для выращивания. Добавьте 25 микролитров по пять миллиграмм на миллилитр раствора МТТ и выдержите в течение четырех часов. Удалите среду и добавьте 250 микролитров диметилсульфа оксида вихря для растворения формы комплексной центрифуги CSM при 2 700 G в течение пяти минут.

Измерьте поглощение надосадочной жидкости на 570 нанометрах, используя 630 нанометров в качестве эталона. Перейдите к определению номера клетки, связанного с CSM, относительно значения поглощения, полученного из известных чисел жизнеспособных A SC. Смешайте пять миллиграммов CSM, загруженного SC, с 7,5 миллиграммами на миллилитр. Коллаген первого типа, извлеченный из крысиных грибов.

Хвостовое сухожилие, отрегулируйте pH до 6,8 с помощью двух нормальных гидроксидов натрия и вылейте в культуральную тарелку. Вставьте для фибриллята, теперь переложите в 12-луночный планшет и выдерживайте 30 минут. Продолжайте обновлять среду для коллагеновых гелей A-S-C-C-S-M через день инкубационного периода.

Также контролируйте, высвобождайте и мигрируйте клетки из CSM в гель с помощью стандартных методов микроскопии. В следующем примере описывается стратегия in vitro по доставке жировых стволовых клеток из микросфер хитозана в каркас коллагенового геля. Изображения СЭМ и ПЭМ указывают на получение пористого ХСМ однородного размера.

Инкубация микросфер с первичными жировыми стволовыми клетками показывает 4000 клеток на миллиграмм кальция CSM. Окрашивание СК показывает растекание по КСМ с расширением филоподий в пористые щели микросферы. Когда загруженные клетками CSM смешиваются с коллагеновым гелем, клетки мигрируют в гель и могут быть прослежены с течением времени.

Применение этой техники сразу же распространяется на терапию массивной и хронической потери тканей. Тем не менее, эта схема лечения имеет гораздо больший потенциал из-за ее универсальности для интеграции с различными клетками и/или биоматериалами, используемыми для лечения различных уровней потерь мягких и сердечных тканей. Сомневаюсь, что этот метод может дать представление о доставке клеток-хозяев.

Он также может быть применен к другим системам, таким как инъекционные препараты, доставка терапевтических препаратов, разработка гибридных систем для доставки клеток и терапевтических препаратов вместе.