Высокая и низкая пропускная способность экранов с галловой нематодой Meloidogyne SPP.

Общая цель данной процедуры заключается в скрининге растений, зараженных галловыми нематодами. Сначала вырастите здоровые проростки в песчаной почве или в пакетах для выращивания. Затем приготовьте инокулят из высокоинфицированных ювенильных особей второй стадии галловых нематод.

Затем проведите надлежащую инокуляцию и заражение проростков. В завершение оцените развитие яичных масс нематод на корневой системе хозяина. Мы продемонстрируем высокопроизводительный и низкопроизводительный скрининг растений с анализом корней, а не самих нематод.

Основными преимуществами системы с высокой пропускной способностью являются минимальные требования к пространству для выращивания растений и простота оценки инфекции. Таким образом, данные подходы обеспечивают воспроизводимое и единообразное заражение корней растений нематодами, что позволяет более точно оценить статус растения как хозяина. Как правило, специалисты, начинающие изучение растений на предмет наличия корневых нематод, часто сталкиваются с трудностями из-за выбора неправильной стадии развития растения для заражения корней.

Также, используя несколькодневных ювенилов инвазионной стадии, которые обычно обладают низкой способностью к заражению, процедура будет продемонстрирована аспирантом и магистрантом. В моей лаборатории я продемонстрирую процедуру скрининга в пакетах для выращивания для проведения горшечных тестов. Посадите семена томата в один горшок, заполненный богатой органикой почвой, такой как Sunshine Mix, поддерживая в теплице температуру от 22 до 28 °C после прорастания.

Один раз в неделю подкармливайте раствором Miracle-Gro; примерно через две недели после прорастания, на стадии двух настоящих листьев, пересадите отдельные проростки в горшки, заполненные стерильной песчаной почвой (90% песка и 10% органического вещества). Добавьте удобрение медленного высвобождения OsmoCoat и содержите растения в теплице при температуре от 22 до 28 °C в течение двух недель. Продолжайте подкармливать раствором Miracle-Gro один раз в неделю.

Для высокопроизводительного скрининга высевайте семена растений непосредственно в лотки с песчаной почвой. Накройте их пластиковой пленкой до прорастания и содержите в условиях, описанных ранее. После прорастания добавьте удобрение с медленным высвобождением Osmo coat и вносите удобрение Miracle-Gro раз в неделю. Проращивайте семена в чашке Петри, выстланной несколькими слоями бумаги Kim White, в инкубаторе при температуре от 25 до 28 °C, а затем перенесите проростки в индивидуальные пакеты.

В качестве альтернативы поместите семена в бумажную канавку для проращивания непосредственно в индивидуальных пакетиках. Поместите пакетики в пластиковые подвесные папки и расположите папки на стеллаже в вертикальном положении.

Поместите штатив в климатическую камеру с поддерживаемой температурой от 25 до 28 °C и 16-часовым светлым периодом. В течение восьмичасового темного периода поливайте пакеты один или два раза в день водой, очищенной методом обратного осмоса, примерно через 10–14 дней после посева. Когда разовьется полноценная корневая система с третичными кончиками корней, проростки будут готовы к инокуляции. Перед началом экстракции яиц тщательно промойте рабочую область и все инструменты горячей водой во избежание контаминации.

Поместите ведро в раковину для сбора жидкости, пропустите через него раствор и установите сверху поддержку из проволочной сетки. Установите три сита друг на друга сверху вниз в порядке уменьшения размера ячеек так, чтобы яйца собирались в сите с размером ячеек 25 micron. Отрежьте верхушки зараженных растений и осторожно утилизируйте их.

Извлеките растение из горшка и промойте корни, окунув их в пластиковое ведро с водой. Продолжайте промывать корни под проточной водой до полного удаления частиц почвы. Затем выделите яйца галловой нематоды из инфицированных корней томата.

Сначала разрежьте корни ножницами на мелкие кусочки, удалив стержневой корень. Поместите измельченные корни одного растения в большой пластиковый флакон с крышкой и добавьте 10% раствор гипохлорита натрия в количестве, достаточном для полного покрытия корней. Закройте крышку и встряхивайте флакон в течение двух минут.

Откройте банку, высыпьте корни на верхнее сито и тщательно промойте их из шланга с распылительной насадкой до полного исчезновения запаха хлорбелеза. Чтобы избежать засорения сита, аккуратно постукивайте по его стенкам киянкой.

Сделайте паузу, снимите верхнее сито и промойте остатки материала. Затем повторите это со вторым ситом. Снимите второе сито и соберите мелкие частицы, включая икру из предыдущего сита, используя слабую струю воды из бутылки.

Сместите остатки материала на одну сторону сита. Соберите остатки и икру в чистый стакан с минимальным количеством воды. Пропустите воду, собранную в ведре, через сито с размером ячеек 25 micron, чтобы собрать возможные пропущенные икринки.

Тщательно промойте водой и соберите в тот же стакан. Застелите чистую металлическую корзинку несколькими слоями салфеток KimWipe и поместите ее в стеклянную чашку Петри так, чтобы между дном корзинки и чашкой оставалось расстояние в один сантиметр.

Вылейте экстрагированные яйца нематод на бумагу в проволочной корзинке. Добавьте достаточное количество жидкости, чтобы дно проволочной корзинки касалось поверхности воды, но не было в нее погружено.

Ежедневно закрывайте верхнюю часть пластиковой крышкой. Проверяйте уровень испарения воды и доливайте воду в чашку Петри так, чтобы дно корзинки касалось воды. Чтобы яйца не пересохли, каждые два дня в течение шести-восьми дней собирайте воду, содержащую ювенильных особей второй стадии (J2), из чашки Петри в стакан.

Если инокулят не используется сразу, его следует немедленно аэрировать при комнатной температуре, используя лабораторную систему подачи воздуха или компрессор для аквариума. Начните следующий этап с перемешивания инокулята на магнитной мешалке при низкой скорости. Используйте три аликвоты собранных нематод.

Для подсчета количества J twos в расчете на предметное стекло или чашку, вычислите среднее значение и определите необходимый объем для инокуляции. На данном изображении представлены J twos при микроскопическом исследовании.

Обычно используют 3000 J twos на одно растение в горшках и 500 J twos для растений, выращенных в кассетах для рассады. Перед инокуляцией растений убедитесь, что почва влажная, но не слишком мокрая. Для инокуляции в горшках сделайте три отверстия глубиной примерно в половину высоты горшка в песке вокруг каждой корневой системы томата.

С помощью карандаша инокулируйте каждое растение, вводя J twos в три отверстия с помощью пипетки. После этого закройте отверстия для высокопроизводительного скрининга в лотках. Используйте модифицированную иглу с герметичным наконечником и боковыми отверстиями, приклеенную к пипетке объемом 5 мл.

Наклоните пипетку, чтобы ввести J twos в почву. Содержите растения в теплице при температуре от 24 до 27 °C в течение шести-восьми недель. Продолжайте подкармливать растения удобрением Miracle-Gro дважды в месяц.

Для оценки степени заражения срежьте верхушки, осторожно извлеките растения из горшков и промойте корни. Затем окрасьте яйцевые массы в синий цвет, погрузив корни в раствор с концентрацией 1 mg/L.

Проводите окрашивание в течение 15 минут. Промойте корни в воде и проведите оценку, подсчитав окрашенные яйцевые массы на отдельных корневых системах. Для облегчения визуализации яйцевых масс и подсчета нематод можно использовать освещенный стереомикроскоп; инокулят перемешивают на магнитной мешалке, как было описано ранее.

Извлеките пакеты из подвесных папок и поместите их на горизонтальную поверхность. Инокулируйте каждый пакет 1 500 особи J2 в пяти миллилитрах. Приподнимите пластиковую крышку пакета и равномерно распределите нематод по поверхности корней.

После инокуляции держите пакеты в горизонтальном положении в течение 24 часов, накрыв их темной бумагой для исключения воздействия света. Затем верните пакеты в подвесные папки в воду в камере роста. Растения следует поливать один или два раза в день в течение примерно трех дней полуконцентрированным раствором Хогланда до появления реакции на удобрение.

Обычно наблюдается усиление озеленения листвы и более интенсивный рост побегов. Через три дня поддерживайте почву в пакетах во влажном состоянии, поливая водой. Приблизительно через 30 дней после инокуляции пролейте каждый пакет примерно 10–20 миллилитрами раствора с концентрацией 75 миллиграмм на литр.

Аэрогляссинг. Оставьте пакеты с красителем в горизонтальном положении на ночь, чтобы корневая система была полностью погружена в раствор. На следующий день слейте краситель из пакетов и оцените корневые системы, подсчитав количество яичных масс с помощью светового стола.

На увеличенном изображении показаны корни сильно зараженного растения томата с широко распространенными яйцевыми массами, окрашенными в синий цвет. Использование лотков позволяет проводить скрининг сотен растений в ограниченном пространстве для выращивания. Использование пакетов для выращивания также позволяет проводить быструю и эффективную неразрушающую оценку инфекций корней и нематод без необходимости промывки корней.

Данный метод также позволяет проводить высокопроизводительный скрининг тысяч растений на ограниченной площади выращивания. Здесь корневая система растения cow P, выращенного в пакете, демонстрирует окрашенные в синий цвет яичные массы после инокуляции. Время заражения имеет критическое значение для проведения анализов растений с нематодами.

Таким образом, задержка заражения даже на несколько дней может привести к очень низкому уровню инфицирования. После просмотра этого видео вы должны иметь четкое представление о том, как заражать растения галловыми нематодами и проводить их оценку. Не забывайте, что с корнями, зараженными нематодами, необходимо обращаться надлежащим образом.

Автоклавирование корней перед их утилизацией позволит ограничить распространение нематоды. Также будьте осторожны при использовании глифозата, так как в высоких дозах он обладает канцерогенным действием.

Следовательно, необходимо использовать перчатки как при работе с корнями, зараженными этим химическим веществом, так и при приготовлении самого вещества.