Анализ Пуркинье морфологии дендритных клеток в органотипической культур Slice

Общая цель этой процедуры заключается в анализе развития дендритного дерева клеток буркини в различных экспериментальных условиях. Это достигается путем предварительного создания органотипических культур срезов постнатального мозжечка мыши. Далее культивируют срезы культур в различных экспериментальных условиях.

Например, проверить действие одного из агонистов MGL R, затем зафиксировать культуры и выявить морфологию отдельных клеток бикини, дендритных деревьев с помощью иммуноокрашивания антикальцинальным кальбиндином. Заключительным этапом является анализ дендритных деревьев клеток Перкина. Выращивание в контролируемых или экспериментальных условиях в конечном итоге является результатом флуоресцентной микроскопии иммуноферментных окрашивающих клеток Перкина, а количественная оценка размера и ветвления их дендритного дерева показывает, что активация рецептора нейромедиатора, в частности MGL Rone, глубоко влияет на развитие дендритного дерева в каждой клетке киндзи.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что почти полный рост прав на конец клетки Перкина происходит в период культивирования, и, таким образом, очень сложная проблема, такая как развитие дендритного дерева, может быть изучена в условиях in vitro. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии развития, например, как активность влияет на рост и развитие нейронных процессов. Чтобы начать эту процедуру, препарируйте мозжечок из мозга щенка мыши ПА в ледяной подготовительной среде под стереомикроскопом.

Затем разрежьте мозжечок на ломтики толщиной 350 микрон в сагиттальной ориентации с помощью измельчителя ткани Макилвейна. После разделения срезов поместите срезы на вкладыши для многопоровых клеточных культур примерно по шесть срезов на вкладыш. Затем инкубируйте их в шести луночных планшетах, предварительно заполненных 0,75 миллилитров инкубационной среды на лунку в увлажненной атмосфере с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия.

Начинайте фармакологическое лечение на третий день in vitro с добавления PMA или DHPG в желаемой концентрации в питательную среду. Обновляют препараты вместе со сменой питательной среды каждые второй-третий день. Для фиксации культуры.

Сначала удалите питательную среду, затем осторожно добавьте три миллилитра, параформный альдегид в каждую лунку, содержащую срезы мозжечка, прикрепленные к мембране милликлетки. Вставка. После фиксации посева на ночь фиксатор удаляют. Впоследствии промойте культуры фосфатным буфером.

Далее добавьте в культуру кроличье противокоровье связывание, разведенное в блокирующем растворе. Разбавляйте кроличий антикальбиндин в соотношении один к 1000 для селективной визуализации клеток киндзи и моноклональный анти-новый N в соотношении один к 500. Для избирательной визуализации гранулярных ячеек в блокирующем растворе.

Инкубируйте культуры с ним в течение ночи при четырех градусах Цельсия при перемешивании. На следующий день трижды промыть культуры 0,1 молярного фосфатного буфера, развести вторичные антитела. Козий антикролик, Alexa 5 68 и козий анти-мышиный Alexa 4 88 от одного до 500 в 0,1 молярного фосфатного буфера, плюс 0,1% Тритон X 100.

Инкубируйте с ним культуры в течение двух часов при комнатной температуре. После трехкратной промывки культур в фосфатном буфере хорошо удалите пятна от срезов с культуры малярной кистью и закрепите их на супер инеях плюс стеклянные стекла. Установите крышки с подходящим монтажным материалом.

Затем рассмотрите культуры на обычном микроскопе с эпифлуоресцентным оборудованием или на конфокальном микроскопе с флуоресцентным мечением клеток бикини. Размер дендритного дерева данной клетки можно легко измерить, если дерево не перекрывается с другими клетками. После того, как клетка бикини с неперекрывающимся дендритным деревом идентифицирована, она рассматривается с помощью линзы 20-кратного увеличения.

Изображение записывается с помощью цифровой камеры, а затем анализируется с помощью программы анализа изображений. В нашем лабораторном образе используется Pro plus. Он позволяет очертить дендритное дерево клетки одним щелчком мыши.

Используя инструмент «Волшебная палочка» в режиме измерения, программа вычисляет площадь, покрытую дендритным деревом, и экспортирует ее в Ms.Xl. Затем выполняется статистический анализ данных с помощью программного обеспечения GraphPad Prism для количества точек ветвления. Из-за сильно разветвленной и тонкой морфологии клеток киндзи дерева ENDR, их необходимо подсчитывать вручную. 20-кратный файл изображения клеток киндзи увеличен таким образом, что он покрывает большую часть экрана с помощью Adobe Photoshop.

Затем каждая точка ответвления подсчитывается и помечается красной точкой. Идентифицированные клетки бикини были неоднократно сфотографированы для мониторинга роста дендритного дерева. Со второго по седьмой дивизион наблюдался непрерывный рост ветвления дендритов.

С четвертого по 11-й дивизион дендритное дерево значительно выросло. Показывать. Вот примеры ингибирования развития дендритного дерева клеток бикини p KC или mgl R, стимуляция A и D показывает необработанные контрольные клетки с хорошо развитым дендритным деревом. После девяти дней лечения PMA дендри кажутся утолщенными, а дендритное дерево сильно уменьшается в размерах, как показано на BNE.

С другой стороны. CNF показали, что после девяти дней лечения DHPG это дендритное дерево значительно уменьшилось в размерах. В отличие от обработки PMA, на первичных и вторичных дендритах присутствовало много очень тонких и коротких боковых ветвей.

Приведенные здесь количественные измерения показывают, что как размер дендритного дерева на верхней гистограмме, так и количество точек ветвей на нижней гистограмме были значительно уменьшены после обработки PMA или DHPG, различия между контролируемыми дендритными деревьями и дендритными деревьями клеток бикини из обработанных культур были значительными. После этой процедуры могут быть применены дополнительные методы, такие как электрофизиология, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как функциональные последствия измененной морфологии дендритного дерева. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как создавать органотипические культуры мозжечковых срезов, а также как анализировать клетки кинии и мифологию.