Корреляционный световой и электронной микроскопии (CLEM) как инструмент для визуализации микроинъекции молекул и их Эукариотические Sub-клеточных мишеней

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы ввести флуоресцентно меченные малые молекулы или белки в цитоплазму культивируемой клетки млекопитающего и наблюдать индуцированные морфологические изменения от микрометрового до многонанометрового разрешения. Это достигается путем культивирования клеток млекопитающих на сетчатых стеклянных покровных листах и микровведения в них флуоресцентно меченной малой молекулы или белка, представляющего интерес. Затем клетки фиксируют в формальдегиде и наблюдают и визуализируют с помощью флуоресцентной микроскопии.

Затем клетки фиксируют глутаральдегидом, разрезают, окрашивают и визуализируют с помощью электронной микроскопии. Наконец, изображения, полученные с помощью светлопольной флуоресцентной и электронной микроскопии, объединяются и выравниваются. В конечном счете, корреляция этих изображений позволяет исследователю получать изображения с высоким разрешением возмущений, вызванных малой молекулой или белком, представляющим интерес

Здравствуйте, я доктор Эван Реддик из лаборатории доктора Нила Альто в отделении микробиологии Юго-западного медицинского центра Техасского университета в Далласе. Сегодня я расскажу вам о процедуре М. Клема или микроинъекции коррелятивного света и электронной микроскопии. Основное преимущество этой процедуры перед отдельными методами, такими как микроинъекции или микроскопия, заключается в том, что здесь они выполняются согласованно и с использованием сетчатого стеклянного покровного стекла.

Именно эта сетчатая обложка позволяет исследователям возвращаться к одной и той же клетке во время разных частей протокола. Кроме того, этот метод дает исследователю возможность наблюдать, как индуцируются субклеточные архитектурные изменения от широкого спектра инъекционных малых молекул или белков, представляющих интерес, и делать это с микрометровым до многонанометрового разрешения. Для подготовки к микроинъекции культивируют такие клетки, как нормальная почка крысы или иммортализированные клетки рака шейки матки на фототравленых стеклянных сетчатых крышках, прикрепленных к двум живым клеточным чашкам, инкубируют клетки при 37 градусах Цельсия и 5% CO2.

В зависимости от используемого экспериментального графика отрегулируйте беглость ячеек. Полностью сливающаяся пластина очень затруднит идентификацию микроинъекций в электронном микроскопе. Таким образом, такие семенные клетки, как они, достигают около 50% беглости в день короткого эксперимента и около 25% беглости ко.

В день более длительного эксперимента приготовьте флуоресцентно меченую белковую ДНК или небольшие молекулы в соответствующем буфере до конечного объема 50 микролитров. В зависимости от выбранного фторорея, добавьте краситель для слежения, например, техасский красный или каскадный синий. Добавьте концентрацию от 0,5 до одного миллиграмм на миллилитр.

Отфильтруйте раствор через центробежный фильтр 0,22 мкм. После вытягивания игл для микроинъекций, следуя рекомендациям производителя, осторожно введите пипетку на микролитры раствора в заднюю часть иглы. Загрузите иглу в рычаг микроманипулятора коммерческого устройства для микроинъекций, прикрепленный к перевернутому микроскопу.

Поместите чашку с культивируемыми клетками в держатель чашки инвертированного микроскопа. Найдите клетки, растущие внутри сетки с фотографиями, и обратите внимание на буквенно-цифровой идентификатор сетки. Это будет использоваться на всех последующих шагах.

Важно выбирать клетки для микроинъекций, которые прилегают близко к центру покровного стекла, и избегать тех, которые находятся ближе к периферии. Это важно, так как это обеспечит эффективный перенос интересующих вас клеток на центральный элемент эпоновой смолы, используемый позже для электронной микроскопии Вручную, вручную опустите инъекционный кронштейн над защитным стеклом и с помощью микроманипулятора опустите иглу до тех пор, пока кончик не будет мягко касаться поверхности клеток. Микро вводит каждую вторую клетку в пределах выбранной сетки для клеток, выращенных с плавностью около 50% Co, и ожидается, что на сетку площадью 600 квадратных микрометров будет около 80 клеток, что даст N от 30 до 40 экспериментальных и контролируемых клеток.

После введения поместите чашку обратно в инкубатор на желаемое время для проведения флуоресцентной микроскопии. Выбросьте питательную среду и зафиксируйте клетки формальдегидом в PBS при комнатной температуре на 10 минут. Замените фиксатор на один XPBS.

Затем задокументируйте расположение ячеек, сделав от 5 до 10 изображений яркого поля выбранной сетки при низком и большом увеличении. Чтобы идентифицировать микроинъекционные клетки, сделайте флуоресцентные изображения на длинах волн возбуждения и излучения глаза инертного инъекционного красителя. Используя конфокальный микроскоп, соберите изображения микроинъекционных клеток с большим увеличением в пределах той же ранее изображенной сетки.

Большое увеличение необходимо для того, чтобы соотнести флуоресцентные изображения с субклеточными структурами, которые будут идентифицированы с помощью электронной микроскопии. После конфокальной визуализации используйте жидкость для удаления покровного стекла, чтобы отделить покровное стекло от чашки и поместить его клеточной стороной вверх в чашку для свежей культуры, содержащую один XPBS. Приступаем к обработке для электронной микроскопии.

Соблюдайте стандартные протоколы ЭМ. Чтобы удалить пятно и обезвожить образцы, приготовьте эпоновую смолу и поместите защитную ячейку скользящей стороной вниз на пробирку, заполненную смолой эон. Дайте смоле полимеризоваться при температуре 60 градусов Цельсия в течение 24 часов.

Чтобы снять крышку, отсоедините ее от эпоновой смолы. Быстро погрузите его в жидкий азот. Температурный шок от 60 градусов по Цельсию до минус 196 градусов по Цельсию.

Выбивает защитное стекло из смоляной трубки. Подождите от пяти до 10 минут, затем извлеките трубку, которая теперь свободна от крышки. Под препарирующим эндоскопом осмотрите поверхность смолы, чтобы найти интересующую сетку.

С помощью стерильного бритвенного лезвия или скальпеля обрежьте эпоновый блок таким образом, чтобы на вершине блока находилась только интересующая вас сетка, с помощью ультрамикротонального разреза последовательных участков обрезанного блока используйте ацетат писсуара и цитрат свинца для контрастирования участков с использованием стандартных протоколов. Переместите нужные клетки в электронный микроскоп, используя взаимное расположение клеток в качестве ориентира. Использование флуоресцентных изображений с высоким разрешением, сделанных ранее.

Определите на электронной микрофотографии интересующие области, соответствующие флуоресцентному сигналу. Используйте такие ориентиры, как положение гетерохроматина и ядерная оболочка, чтобы определить, какое флуоресцентное изображение Зака соответствует электромагнитному срезу. Если изображение создается с помощью программы обработки изображений, такой как Image J или Adobe Photoshop, уменьшите непрозрачность флуоресцентного изображения до 50% и наложите его на соответствующее изображение ПЭМ.

Выровняйте изображения, отрегулировав отображаемый масштаб. Вот результаты микроинъекции и корреляционной световой и электронной микроскопии. На этом изображении показана светлопольная микрофотография NRK-клеток, растущих на покровном листе из стекла с лазерной гравировкой.

Обратите внимание на фоновые буквы b и m, используемые для идентификации сетки, содержащей введенные клетки. Стрелками обозначены две клетки, идентифицированные и визуализированные с помощью электронной микроскопии. Здесь показано флуоресцентное изображение инертного синего цвета для слежения, используемого для идентификации микроинъекционных клеток.

Вот наложение светлых и флуоресцентных сигналов малой молекулы, меченной амином. Эта панель представляет собой корреляцию светлопольной флуоресцентной и электронной микроскопии введенной клетки. Стрелка указывает на флуоресцентные точки, изображенные при большем увеличении на этой панели.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как проводить микроинъекции интересующего вас белка и отслеживать его субклеточные морфологические изменения, которые он вызывает, используя процедуру микроинъекции Клема или корреляционную световую и электронную микроскопию.