Закрытые нуклеиновых кислот цитометрии потока флуоресценции На месте Гибридизация (LNA поток-FISH): Метод бактериального Малый обнаружения РНК

Общая цель данной процедуры — обнаружение экспрессии бактериальной РНК в отдельных бактериальных клетках. Для этого сначала разрабатывается зонд на основе заблокированных нуклеиновых кислот (LNA) с модификацией biotin TEG на 5'-конце. После фиксации бактериальных клеток, обработки dathyl, перкарбонатом или dsy и последующей пермеабилизации РНК денатурируют, после чего проводят гибридизацию с LNA-зондом.

В Thirdly, клетки промывают, блокируют и окрашивают. В завершение измеряют клеточную флуоресценцию методом проточной цитометрии. В конечном итоге можно оценить изменения в экспрессии РНК с течением времени и внутри популяций.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о относительном присутствии и количестве видов РНК в одной клетке, а также о степени изменения этой экспрессии в гомогенных или гетерогенных популяциях. Хотя в настоящее время данный метод используется для мониторинга экспрессии малых РНК бактерий, теоретически его можно применять для обнаружения РНК практически в любом типе клеток. После разработки последовательности LNA-зонда используйте blast, чтобы убедиться в специфичности зонда только к интересующей вас SRNA или mRNA.

При заказе зонда добавьте модификацию biotin TEG на 5'-конец L LNA-олигонуклеотида. Биотинилирование необходимо для последующего окрашивания после гибридизации с использованием конъюгата стриптинавидина с дигоксигенином. В метод следует включить три отрицательных контроля, один из которых — контроль без LNA, при котором LNA-зонд не добавляется в процессе гибридизации.

Шаг второй: контрольный образец без красителя, в котором LNA-зонд гибридизуется с целевой sRNA, но событие гибридизации не регистрируется из-за отсутствия флуоресцентного красителя. И третий: контрольный образец с неэкспрессируемой sRNA или mRNA, в котором используется LNA-зонд, нацеленный на отсутствующую или неэкспрессируемую sRNA, для мониторинга неспецифической гибридизации. Начните со сбора 1×10⁸ клеток интересующих бактерий и их переноса в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Затем осадите бактериальные клетки центрифугированием при 2300 ×g в течение пяти минут.

Удалите супернатант с помощью пипетки, не используя декантацию. Затем ресуспендируйте осадок в 400 µL PBS, добавьте 400 µL фиксирующего раствора (PFA, уксусная кислота, PBS) и тщательно перемешайте клетки. Инкубируйте суспензию в течение 10 минут при 25 °C.

Перемешайте на вортексе один раз через пять минут после повторного центрифугирования клеток. В этот раз центрифугируйте при 4 500 ×g в течение двух минут. Промойте осадок дважды, используя 400 µL PBS.

В завершение ресуспендируйте осадок в 400 µL PBS и храните зафиксированные клетки при температуре 4 °C в течение периода до семи дней. Начните с добавления 400 µL свежеприготовленного 1% раствора dsy в каждый образец зафиксированных бактериальных клеток. Затем тщательно перемешайте клеточные суспензии путем пипетирования.

Инкубируйте эту смесь в течение 12 минут при 25 °C, затем, после двукратной промывки клеток 400 µl PBS, добавьте к клеткам 800 µl свежеприготовленного раствора лизоцима. Тщательно перемешайте раствор клеток с лизоцимом с помощью вортекса и инкубируйте клетки в течение 30 минут при 25 °C, периодически перемешивая. После центрифугирования клеток добавьте 800 µl свежеприготовленного раствора протеиназы K к осадку и тщательно перемешайте ресуспендированный раствор клеток путем пипетирования.

Инкубируйте клетки в течение 15 минут при 25 °C, перемешивая на вортексе в середине периода инкубации. После центрифугирования и промывки клеток 400 µL PBS ресуспендируйте клетки в еще 400 µL PBS и перенесите по 100 µL суспензии в четыре отдельные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, затем осадите клетки и удалите супернатанты. Теперь инкубируйте все четыре образца, каждый в 100 µL гибридизационного буфера, при 60 °C в течение 60 минут. После гибридизации добавьте один мл SSC с tween 20 (SSCT) к гибридизационной смеси, чтобы извлечь клетки из вязкого гибридизационного раствора.

После центрифугирования осадка клеток к ним добавляют 200 µL раствора формамида в SSCT и тщательно перемешивают. Затем образцы инкубируют в течение 30 минут при 65 °C в термоблоке. Далее к смеси добавляют 1 mL SSCT, и после повторного осаждения клеток их снова суспендируют в 500 µL SSCT, после чего раствор клеток инкубируют в термоблоке в течение 40 минут.

После центрифугирования к осадку гибридизированных клеток добавляют 200 µL блокирующего буфера, затем клетки инкубируют в течение 30 минут при 25 °C. После повторного центрифугирования к осадкам клеток для контроля без красителя добавляют 50 µL раствора стриппированного авидина и красителя, затем тщательно перемешивают. Добавляют 50 µL блокирующего буфера.

Инкубируйте все образцы еще в течение 12 минут при 25 °C с постоянным перемешиванием в термомиксере, защищая пробирки от света алюминиевой фольгой. Затем промойте клетки один раз 500 µl буфера SSCT и один раз 400 µl PBS с добавлением tween 20 или PBST. После удаления супернатантов добавьте 100 µl биотинилированных антител к strippin и PBS; инкубируйте в течение 30 минут при 25 °C с периодическим перемешиванием. Данное антитело свяжется с конъюгатом strippin DI, введенным на предыдущем этапе.

Затем после центрифугирования и двукратной промывки клеток 400 µL PBST проведите повторное окрашивание, добавив к клеткам 50 µL раствора стриппированного авидина с красителем и тщательно перемешав. Этот этап увеличивает интенсивность сигнала на один гибридизованный LNA-зонд для контроля без красителя. Снова добавьте только 50 µL блокирующего буфера, а затем инкубируйте все пробирки в течение 12 минут при 25 °C в термомиксере при постоянном перемешивании.

После инкубации с раствором красителя повторно промойте клетки 500 µL буфера SSCT, а после второй промывки — 400 µL PBST. Ресуспендируйте осадок в 200 µL PBST и храните клетки при температуре 4 °C до начала анализа методом проточной цитометрии. Для анализа мелких бактериальных клеток установите низкую скорость потока на проточном цитометре, чтобы уменьшить размер ядра потока. Кроме того, в случае использования проточных цитометров с пороговым отсечением прямого светорассеяния, установите порог на минимально возможное значение, чтобы обеспечить детектирование мелких бактериальных клеток.

Пример клеток, подвергнутых эффективной фиксации и пермеабилизации, представлен на данном точечном графике проточной цитометрии при использовании только что описанных условий. После пермеабилизации популяция клеток невелика и гомогенна, что указывает на малое количество клеточных агрегатов. Однако при использовании более высоких концентраций лизоцима клетки более склонны к агрегации, что проявляется в увеличении значений прямого светорассеяния, свидетельствующих о наличии более крупных частиц, как видно на этом точечном графике.

Здесь представлен пример данных проточной цитометрии, полученных в ходе успешного эксперимента LNA flow fish. Гистограмма демонстрирует специфическое детектирование целевой SRNA наряду с тремя отрицательными контролями. Отрицательный контроль без красителя (фиолетовый цвет) дает наименьшую флуоресценцию, за ним следуют отрицательные контроли без LNA и с неэкспрессируемой SRNA (синий и красный цвета соответственно).

Наконец, образец со специфическим LNA-зондом на SRNA дает наиболее сильную флуоресценцию в черном цвете. При наличии соответствующего опыта эта процедура может быть выполнена примерно за шесть часов при правильном соблюдении протокола. Кроме того, данный метод предоставляет больше информации и является более экономически выгодным, чем R-T-P-C-R.

После выполнения данной процедуры можно пометить дополнительные зонды другими HAPS и добавить их на этапе гибридизации для обеспечения мультиплексного детектирования РНК.I.