Исследование кишечного воспаления в DSS-индуцированной модели IBD

Экспериментальные модели воспалительных заболеваний кишечника позволили нам изучить сложный врожденный и адаптивный иммунный ответ связана с патогенезом. Использование гистологического забил, количественное определение провоспалительных цитокинов и активность миелопероксидазы, можно приступить к оценке этих ответов видно при воспалительных заболеваниях кишечника.

Общая цель этой процедуры заключается в оценке иммунного ответа кишечника, индуцированного декстроном сульфатом натрия, путем определения количества активности миелопероксидазы и провоспалительных цитокинов, вырабатываемых в ответ на воспаление. Первый колит DSS индуцируется у мышей путем введения в питьевую воду раствора DSS SALT. Затем тяжесть заболевания колита оценивается с помощью макроскопической оценки и толстая кишка удаляется для дальнейшего анализа.

Затем рассеченная толстая кишка разрезается на три части для гистологии, количественного определения цитокинов и активности NPO. Наконец, ткань толстой кишки гомогенизируется, и надосадочная жидкость используется для определения активности МПО. В конечном счете, изменения в активности МПО могут быть определены с помощью данных об поглощении, собранных с помощью спектрофотометра.

Этот метод может дать представление о хронической информации о различных моделях воспалительных заболеваний кишечника, таких как колит, вызванный DSS и TNBS. Кроме того, вы можете использовать этот метод в других органах, таких как легкие и печень Перед началом процедуры. Замените питьевую воду в каждой клетке для мышей раствором DSS, чтобы вызвать воспаление.

Дайте контрольным мышам питьевую воду в автоклаве без DSS. Затем в день эксперимента рассеките толстую кишку, как было показано ранее в статье Уитхэма Уильямса и Уильямса в JoVE. Осторожно выдавите кал из всей толстой кишки с помощью согнутого пинцета, собрав его в бумагу для взвешивания, промыв ткань стерильным PBS.

Оцените стул с помощью пары щипцов, чтобы надавить на кал, чтобы определить его консистенцию и определить оценку крови в кале. Обратите внимание на цвет кала и дополнительно подтвердите оценку с помощью гемокультного теста, который включает в себя размазывание кала по гемокультной бумаге, добавление проявителя, а затем заметку о том, что синий цвет означает положительный анализ кала на кровь. Затем используйте эту таблицу для определения значения для каждого из условий.

Далее, сохраняя проксимальную и дистальную ориентацию толстой кишки, разрежьте толстую кишку на три равные части. Затем берут образцы из проксимального и среднего отделов ободочной кишки и помещают образцы в отдельные 1,5-миллилитровые пробирки с ЭФГ. Для оценки гистологического повреждения тяжести колита используют самый дистальный участок ткани толстой кишки и отрезают небольшой фрагмент длиной от половины до одного сантиметра.

Поместите фрагмент в тканевую кассету и погрузите кассету в буферный 10% раствор формалина. Затем, после подготовки парафиновых залитых срезов фрагментов ткани, окрасить срезы гематином эоином для подсчета слепым наблюдателем. Наконец, заморозьте образцы из проксимального и среднего срезов коллона в жидком азоте и храните их до использования при температуре минус 70 градусов Цельсия.

После извлечения образцов толстой кишки из хранилища минус 70 градусов Цельсия поместите их на лед. Затем с помощью согнутых щипцов удалить любые видимые каловые массы или жир, и поместить их в отдельные двухмиллилитровые трубки, пригодные для использования в гомогенизаторе. Затем определите и запишите вес каждой пробы.

Затем добавьте гранулы гомогенизатора в каждую пробирку с образцом, а затем добавьте в пробирку соответствующее количество буфера H-табулы в соответствии с только что определенным весом ткани, диссоциируйте фрагменты тканевым гомогенизатором в течение четырех минут при 30 герц. Наконец, центрифугируйте раствор ячейки в течение шести минут при температуре 13, 400 G и четырех градусах Цельсия. Соберите надосадочную жидкость в свежую пробирку, а затем, убедившись, что шарик гомогенизации сохранился, выбросьте образовавшуюся гранулу.

Затем надосадочную жидкость можно хранить при температуре минус 70 до использования. Начните этот шаг с добавления семи микролитров ранее подготовленного гомогената тканей в трех экземплярах в 96-луночную пластину. Затем добавьте 50 микролитров разведенной перекиси водорода в свежеприготовленный ОД Дион йод.

С помощью многоканальной пипетки добавьте по 200 микролитров смеси перекиси водорода в каждую из лунок. Теперь измерьте поглощение 550 нанометров с помощью спектрофотометра, сняв три показания с 32-м интервалом. Затем, используя данные об абсорбции, массе ткани и объеме буфера, рассчитайте активность NPO в гомогенатах, как показано в этом расчете образца.

В течение всего периода лечения DSS индекс активности заболевания может быть использован для оценки и оценки клинического прогрессирования заболевания. Животные, получавшие DSS, демонстрируют значительную потерю веса по сравнению с их первоначальным весом, жидкий стул и фекальные кровотечения. Чем более существенные, чем макроскопические системы, тем выше индекс активности заболевания.

После умерщвления и обследования толстой кишки мышей, которым вводили 5% DSS в питьевой воде в течение пяти дней, тяжесть колита, основанная на макроскопической оценке сокращения длины толстой кишки, кровотечения из толстой кишки, фекального кровотечения, разжижения консистенции стула и признаков ректального кровотечения для этого репрезентативного эксперимента, была определена примерно в пять раз хуже, чем в контрольной группе, получавшей только воду, как показали эти данные поперечных срезов DSS. Образцы тканей толстой кишки, такие же, как H и E, имеют более высокие гистологические показатели, чем контрольная группа, обработанная водой. Здесь нормальная архитектура и отсутствие клеточного инфильтрата могут быть отмечены в области, обозначенной звездочкой на этом окрашенном поперечном срезе h и e, полученном от контрольного животного, которое получало только воду. Теперь сравните это окрашивание h и e образца животного, обработанного A DSS, с предыдущим рисунком.

Толстая кишка этого животного демонстрирует большее количество гистологических повреждений, о чем свидетельствует большая клеточная инфильтрация, о чем свидетельствует знак фунта, а также большее истощение бокаловидных клеток и большее искажение. Повреждение архитектуры крипты K, обозначенное звездочкой. Для дальнейшей характеристики степени тяжести заболевания у мышей, получавших DSS, активность НПО, суррогатный маркер воспаления может быть оценен по образцам гомогенизированной ткани толстой кишки.

Как и ожидалось, толстые кишки, обработанные DSS, имеют более высокую активность NPO, чем контрольная группа. Кроме того, тяжесть колита, вызванного DSS, связана с повышением уровня провоспалительных цитокинов, таких как IL один, бета, IL 6 и TNF альфа. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что активность MPO может со временем снижаться.

Поэтому анализ МПО должен быть одним из первых анализов, выполняемых при определении тяжести воспаления кишечника.