Сегментация и измерение объемов жира в мышиной модели ожирения Использование рентгеновской компьютерной томографии
4 апреля 2012 г.
Жир контент-анализ регулярно проводится в исследованиях с использованием мышиной модели ожирения. Новые методы в маленькое животное КТ и анализ обеспечения продольной подробно богатых жиром контент-анализ. Здесь мы подробно шаг за шагом процедуры для выполнения мелких животных КТ, анализа и визуализации.
Общая цель данной процедуры заключается в неинвазивной количественной оценке и визуализации содержания жира у живых мышей. Это достигается путем предварительного проведения рентгеновской КТ мыши. Вторым этапом процедуры является сегментация и количественное определение объемов жира в организме мыши на основе рентгеновской плотности.
Третьим этапом является трехмерная визуализация данных КТ, при которой объемы жира выделены красным цветом. В конечном итоге полученные результаты позволяют количественно определить и визуализировать содержание жира в ходе лонгитюдных исследований in vivo с использованием рентгеновского КТ-сканера albia в сочетании с программными пакетами PMOD и vol view. Одним из ключевых преимуществ данного метода по сравнению с существующими подходами, такими как ex vivo анализ, является возможность неинвазивной и лонгитюдной оценки жировой ткани в моделях заболеваний на мелких животных.
Как правило, специалисты, впервые применяющие данный метод, могут столкнуться с трудностями, поскольку протокол сегментации и визуализации включает несколько этапов, которые необходимо выполнять последовательно. Кроме того, при сборе данных следует использовать оптимальные параметры рентгеновского излучения. Для получения наилучшего контраста жировой ткани начните с анестезии нужных мышей с ожирением с использованием индукционной камеры, после чего переведите их на носовой конус.
Поддерживайте анестезию во время визуализации; поместите мышей в стандартную подложку для крыс конечностями латерально по отношению к туловищу. Это обеспечит равномерность получения КТ-изображений. Настройте систему КТ на сканирование области длиной 115 мм с использованием 600 проекций.
Установите ток рентгеновского источника на 200 microamps, а пиковое напряжение — на 45 kilovolt, и используйте алюминиевый фильтр толщиной 0.5 millimeter для ужесточения пучка. Эквивалентная глубокая доза облучения, которую получит мышь при данных настройках, составляет приблизительно 220 milli sieverts, в то время как эквивалентная поверхностная доза, согласно данным компьютера, составляет 357.4 milli sievert. Для реконструкции изображений выберите алгоритм FBP со стандартными параметрами.
В конечном итоге получается итоговое изображение с изотропным разрешением 125 микрон, которое может быть использовано для анализа изображений всего животного. Анализ изображений выполняется с помощью программного обеспечения PMOD: сначала PMOD сегментирует изображения в соответствии с плотностью тканей, а затем определяет объем жира. После загрузки изображения уменьшите его размер, чтобы минимизировать вычислительные затраты.
Перейдите на вкладку основного представления (main view), выберите инструменты (tools), а затем — уменьшение (reduce). Установите значения уменьшения на два для X, два для Y и два для z, нажмите «ОК» (check), выберите «заменить» (replace) и запустите процесс. По завершении процесса появится сообщение.
Чтобы исключить элементы ложа и носового конуса из изображений, замаскируйте их перед анализом VOI. Перейдите в раздел planes layouts, rotations, mirror 3D markers и выберите planes and layouts. Выберите show plane Z. Затем прокрутите до носового конуса в плоскости Z.
Затем перейдите на вкладку основного VOI и выберите функцию рисования вершин (draw vertices). Очертите ROI вокруг носовой части, исключая основание и носовой конус, и выберите опцию копирования фактического ROI друг на друга (copy actual ROI to each other). Выполните сечение по элементу носового конуса.
При необходимости перенесите ROI из буфера на область носа. Используйте команду редактирования группы вершин (edit group of vertices) для корректировки ROI. Когда конусы носа перестанут быть видны, удалите ROI и создайте VOI, охватывающий обхват тела животного.
Перейдите в инструменты VOI, затем выберите маскирование и алгебру. Введите -1000 в появившемся диалоговом окне. Затем нажмите кнопку Mask voxels outside the selected vois (Маскировать воксели вне выбранных VOI).
Когда появится сообщение «Операция с данными необратима, хотите ли вы продолжить?», выберите «Да». Теперь перейдите в разделы «Plane layouts» (Расположение плоскостей), «Rotations» (Повороты), «Mirror 3D markers» (Зеркалирование 3D-маркеров) и, наконец, «Planes and layouts» (Плоскости и расположение). Выберите «Show all planes» (Показать все плоскости).
Проверьте целостность VOI. Если VOI выглядит корректно, сохраните его как файл анализа и измените префикс имени файла. Перейдите к сегментации изображения для определения общего объема животного.
Начните с выбора инструментов и внешних параметров. Затем установите флажок сегментации. Введите диапазон от -300 до +3 500 и запустите сегментацию.
Затем выберите статистику VOI, в которой представлены данные об общем объеме. Зафиксируйте значение этого объема. Теперь выполните сегментацию изображения для определения объема жировой ткани, предварительно вернувшись к несегментированному изображению массы.
Во-вторых, загрузите сохраненный файл с данными масс и отметьте флажком пункт «analyze» в окне загрузки. Затем выберите раздел «tools», а далее — «external». После этого отметьте флажком пункт «segmentation».
Введите диапазон от -200 до -50 и запустите сегментацию. После подтверждения результатов выберите VOI.Statistics. Обратите внимание, что представленные статистические данные соответствуют объему жировой ткани.
Сохраните результаты в проанализированном формате и укажите уникальный префикс имени файла. Однако, если в образце сохранились области кожи или периферической плотности, используйте протокол эрозии и дилатации, чтобы удалить эти области для анализа VOI. Перед сохранением перейдите в раздел tools external и выберите флажок morphological в появившемся окне.
Выберите эрозию, затем вернитесь к флажку морфологических операций, выберите дилатацию и убедитесь, что проблема с кожей или периферической плотностью решена, после чего сохраните результаты. Используйте программный пакет Volvo view версии 3.2 для создания рендерированных 3D-визуализаций сегментированных изображений.
Начните с открытия набора данных КТ, сохраненного в формате analyze. Используйте настройки по умолчанию в появившемся окне, затем откройте меню плагинов (plugins) и в разделе утилит (utility) выберите «объединение объемов» (merge volumes). Снимите флажок с пункта «масштабирование компонентов» (rescale components).
Нажмите «назначить второй вход» (assign Second input). В качестве второго входа выберите сегментированные данные жировой ткани и используйте настройки по умолчанию в появившемся окне. Затем примените плагин, чтобы получить увеличенное изображение подопытной мыши.
Дважды щелкните по окну просмотра объема. Вернитесь на вкладку Color / Opacity (Цвет / Непрозрачность). В раскрывающемся списке Component (Компонент) указывается набор данных, который редактируется в данный момент.
В нижней части вкладки расположены два ползунка. Они определяют относительную яркость каждого компонента набора данных в режиме наложения, используя значения от нуля до единицы. Например, чтобы изменить цвет на градации серого, перейдите в раздел скалярного отображения цветов.
Дважды щелкните по одному из ползунков и перетащите его за пределы рамки. Добавьте второй ползунок, щелкнув в любом месте области ползунков. Установите черный цвет для левого цветового ползунка и белый — для правого.
Затем перейдите к окну сопоставления скалярной прозрачности (scalar opacity mapping) и создайте новую точку, щелкнув внутри этого окна. Таким образом, в окне будет три точки, включая среднюю. Измените скалярное значение примерно на -3000, а значение прозрачности установите на ноль.
Справа в окне находится третья точка; измените ее скалярное значение примерно на 32 000, а непрозрачность — на 0,25. Первую точку можно расположить в любом месте слева, при условии, что значение непрозрачности установлено на ноль. При установленном скаляре переключитесь на второй компонент, который отвечает за внешний вид жира; измените цвет каждого ползунка на красный, дважды щелкнув по нему и переместив ползунок цветового тона H в крайнее положение.
Здесь жировая ткань окрашена в красный цвет. Чтобы создать трехпанельное видео с вращением, отображающее КТ жировой ткани и наложение, сначала нажмите и перетащите мышью объект в вертикальное положение спиной к Вам. Во-вторых, в разделе весов компонентов (component weights) установите значение второго компонента на ноль, чтобы отображался только КТ-скан. В-третьих, выберите пункт «review», затем «camera» и укажите количество кадров для видео с вращением. В-четвертых, измените значение вращения по оси X на 360 градусов.
В появившемся диалоговом окне выберите пятый пункт «create». Создайте новую папку с названием CT и сохраните файл в формате TIF, в результате чего будет выведена серия изображений ротации. Повторите эти действия для изображения жировой ткани, а также для совмещенного изображения жировой ткани и CT, сохраняя изображения ротации в отдельные папки. Чтобы создать видео ротации из полученных изображений, откройте программу ImageJ и импортируйте последовательности изображений.
Выберите первое изображение в папке CT, и остальные будут выбраны автоматически. Повторите этот процесс для последовательностей fat и overlay с одним из стеков. Оставьте окно открытым.
Откройте менеджер ROI (ROI manager). Он находится в меню инструментов анализа (analyze tools). С помощью менеджера ROI обведите исследуемую мышь, исключая из области выделения ненужные пиксели фона. По завершении нажмите кнопку «add» в менеджере ROI.
Затем примените одну и ту же область интереса (ROI) к каждой последовательности изображений. Когда ROI будет установлена на всех стеках, щелкните правой кнопкой мыши. В меню ROI выберите «duplicate» (дублировать) и нажмите «select» (выбрать). Отметьте дубликат стека.
Это позволяет отделить ROI от остальной части изображения. Теперь закройте стеки больших изображений и повторите эту процедуру для всех трех последовательностей изображений. Чтобы объединить стеки, используйте команду combine, которая находится в меню stacks, а затем tools.
Выберите КТ-стек в качестве первого стека и жировой стек в качестве второго. Затем повторите процесс, выбрав вновь объединенные стеки в качестве первого стека и наложенный стек (overlay stack) в качестве второго.
На этом завершается создание стека вращения изображений из трех панелей. Для предварительного просмотра стека выберите «play» в левом нижнем углу окна изображения. Затем сохраните его в формате AVI.
Для демонстрации возможностей системы Alber CT были использованы мыши линии B6VLEOB. Для измерения содержания жира с помощью КТ их сравнивали с мышами дикого типа C57BL/6. Слева представлен общий объем КТ-сканирования мыши с ожирением.
В центре красным цветом показан объем жира, справа представлено совмещенное изображение. Аналогичный анализ животных дикого типа демонстрирует существенную разницу в содержании жира по сравнению с мышью с ожирением. Для каждого животного были рассчитаны общий объем, объем жира и объемные соотношения.
Среднее соотношение объема жира к общему объему для группы дикого типа и группы с ожирением составило 0,09 и 0,42 соответственно. Эти значения значимо различались при P = 0,001. После просмотра этого видео зритель должен получить четкое представление о том, как проводить сегментацию объемов жира в наборе данных КТ живой мыши после освоения данной методики.
Выполнение данной методики должно занять менее 30 минут. Спасибо за просмотр, до новых встреч.
Обзор
В данной статье подробно описывается неинвазивный метод визуализации и количественного определения содержания жира у живых мышей с использованием рентгеновской КТ. Эта процедура позволяет проводить лонгитюдные исследования на моделях ожирения у мышей, что способствует более глубокому пониманию распределения и объема жировой ткани.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология
- Методы визуализации
Теоретические основы
- Анализ содержания жира имеет решающее значение в исследованиях ожирения.
- Традиционные методы могут быть инвазивными и менее информативными.
- Достижения в области КТ-визуализации позволяют детально изучить распределение жира.
- Данный метод позволяет проводить лонгитюдные исследования на живых объектах.
Цель исследования
- Разработать протокол неинвазивной визуализации для количественного определения жира.
- Обеспечить возможность визуализации содержания жира в моделях мышей.
- Обеспечить возможность проведения лонгитюдных оценок изменений содержания жира с течением времени.
Используемые методы
- Рентгеновская КТ-сканирование анестезированных мышей.
- Сегментация объемов жировой ткани на основе рентгенологической плотности.
- 3D-визуализация данных КТ с использованием программного обеспечения PMOD и VolView.
- Пошаговые протоколы анализа изображений и количественного определения объема.
Основные результаты
- Успешная неинвазивная визуализация содержания жира у живых мышей.
- Количественные данные об объеме жира, полученные с помощью сегментации.
- 3D-визуализации эффективно демонстрируют распределение жира.
- Метод демонстрирует преимущества по сравнению с традиционными инвазивными методами.
Выводы
- Разработанный метод позволяет проводить детальный анализ содержания жира в моделях мышей.
- Он поддерживает лонгитюдные исследования, расширяя возможности изучения ожирения.
- Данная методика может стать ценным инструментом для исследователей в этой области.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Количественное неинвазивное измерение объема жировой ткани в моделях мышей с помощью рентгеновской КТ позволяет проводить надежные лонгитюдные исследования в области метаболических заболеваний. Этот подход повышает прогностическую уверенность при валидации мишеней и снижении механистических рисков при разработке препаратов для лечения ожирения и метаболического синдрома. Данный метод обеспечивает трансляционную преемственность, предоставляя воспроизводимые данные об адпозности в конкретных областях, что имеет решающее значение для принятия решений на доклиническом этапе.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Раннее обнаружение и валидация мишени
- Позволяет проводить проверку гипотез относительно путей развития ожирения в генетических или индуцированных воздействием окружающей среды моделях ожирения.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем количественного определения изменений распределения жира в ответ на воздействие потенциальных препаратов или методов терапии.
- Способствует снижению механистических рисков, предоставляя объективные количественные конечные точки для исследований на ранних этапах.
Скрининг и разработка анализа
- Подготовка валидированных количественных методов визуализации для последующего скрининга соединений на моделях метаболических заболеваний.
- Стандартизация протоколов измерения объема жира, что повышает воспроизводимость и сопоставимость данных между исследованиями.
- Создание масштабируемых наборов данных с высоким содержанием информации, пригодных для скрининга и фенотипического профилирования.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет доклинические конечные точки с клиническими методами визуализации, поддерживая стратегии трансляционных биомаркеров.
- Обеспечивает лонгитюдный мониторинг прогрессирования заболевания и терапевтического ответа in vivo.
- Снижает биологический риск, обеспечивая неинвазивные, воспроизводимые измерения в когортах исследования.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный рабочий процесс визуализации и сегментации охватывает этапы от раннего поиска до доклинической валидации, обеспечивая идентификацию ведущих соединений и трансляционные исследования в рамках портфеля препаратов для лечения метаболических заболеваний.
- Поисковая биология: обеспечивает количественные измерения жира в конкретных областях для проверки гипотез и анализа сигнальных путей.
- Скрининг: предоставляет воспроизводимые стандартизированные методы визуализации для оценки соединений.
- Аналитика: выводит количественные показатели содержания жира и отношения общего объема, что позволяет проводить статистическое сравнение между экспериментальными группами.
- Трансляционные исследования: связывает доклинические и клинические конечные точки визуализации для согласования биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: создает многоразовую платформу визуализации и анализа для различных исследований метаболизма и ожирения.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и снижает неопределенность механизмов в исследованиях моделей ожирения.
- Операционная ценность: Улучшает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость рабочих процессов количественного определения жира.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала за счет обеспечения надежного неинвазивного лонгитюдного сбора данных.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию с учетом рисков и продвижение активов в области лечения метаболических заболеваний.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с лабораторными животными, навыками проведения анестезии и протоколами КТ-визуализации.
- Необходим доступ к специализированным системам рентгеновской КТ для мелких животных и программному обеспечению для расширенного анализа изображений (PMOD, VolView).
- Требуется межгрупповая стандартизация параметров визуализации и порогов сегментации.
- Может потребоваться адаптация метода для различных моделей животных или платформ визуализации.
- Радиационное облучение и вычислительные затраты должны контролироваться в соответствии с требованиями исследования.
![Визуализация и количественная оценка коричневых и бежевых жировых тканей у мышей с использованием [18F]FDG Micro-PET/MR Визуализация](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F62460.jpg%3Fv%3D2026-09-01T23%253A07%253A35.000Z&w=384&q=75)
