Создание Переходные поры клеточной мембраны с помощью стандартных струйных принтеров

Общая цель этой процедуры заключается в создании переходных пор в клеточных мембранах с помощью струйной печати. Это достигается путем предварительной модификации стандартного струйного принтера. Второй шаг — опорожнение и очистка стандартного картриджа с чернилами принтера, чтобы в него можно было вставить биочернила.

Затем интересующие клетки суспендируют в растворе флуоресцентно меченных актоновых мономеров и PBS для создания раствора биочернил. Заключительным этапом является печать биочернил на предметных стеклах микроскопа с помощью модифицированного принтера и картриджа. В конечном счете, флуоресцентная микроскопия может быть использована для того, чтобы показать, что четыре сопряженных мономера G-актина Fluor были интернализованы напечатанными клетками через переходные мембранные поры.

Основное преимущество этой методики перед стандартными методами трансфекции и микроинъекции клеток заключается в том, что эта техника печати проста в использовании и обеспечивает высокую жизнеспособность клеток. Хотя этот метод может дать представление о генетике, он также может быть применен в других областях исследований, таких как клеточная биофизика и тканевая инженерия в клеточной биофизике. Этот метод может быть использован для легкого наблюдения за цитоскелетом клетки во время миграции клеток.

Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы хотели иметь возможность визуализировать изменения в расположении цитоскелета из-за приложенных к клеткам сил. Начните с разблокировки пластиковых зажимов на нижнем основании принтера, а затем медленно снимите верхний пластиковый корпус. Затем отсоедините световую панель дисплея кнопок от верхней части принтера, оставив ее подключенной к материнской плате принтера.

Использование салфеток Kim и этанола. Очистите внутреннюю часть принтера, особенно места, где находится картридж с чернилами и где происходит печать. Затем найдите кабель, подающий питание на механизмы подачи бумаги для настольного принтера HP Jet 500.

Они находятся чуть ниже лотка для бумаги слева от передней панели и отсоедините кабели от материнской платы. Теперь найдите механизм обнаружения бумаги, закрепите проволочную петлю на сером пластиковом рычаге, расположенном выше, и за механизмом подачи печатной бумаги, который служит ручной ручкой, поместите здесь столик. Пенопластовый держатель для 15 центрифужных пробирок используется с несколькими предметными стеклами микроскопа, закрепленными в области печати перед механизмом подачи бумаги, чтобы довести желаемые печатные стекла до уровня чуть ниже печатающей головки картриджа.

Наконец, для поддержания асептической техники поместите принтер внутрь колпака с ламинарным потоком. Начните с извлечения картриджа из упаковки, оставив защитную ленту, закрывающую контакты принтера и печатающую головку. Стабилизируйте корпус картриджа с помощью зажима, не допуская никаких препятствий с помощью ручного вращающегося режущего инструмента.

Отрежьте зеленую верхнюю часть картриджа, слейте остатки чернил из резервуара, а затем снимите пластиковую защитную ленту, закрывающую контакты принтера и печатающую головку. Во время этого процесса вода, скорее всего, будет вытекать из печатающей головки, но это не причинит никакого вреда картриджу. Когда вода станет прозрачной, дайте картриджу высохнуть.

Чтобы поддерживать чистоту при печати, начните с полного погружения картриджа в стакан с деионизированной водой, а затем произведите ультразвуковую обработку картриджа в течение 15 минут. После ультразвуковой обработки извлеките картридж и вытряхните лишнюю воду. Распылите 70% этанола в картридж, чтобы создать более асептическую среду.

После сбора интересующих клеток центрифугируйте клетки в пяти миллилитрах свежей среды в конической центрифужной пробирке объемом 15 миллилитров в течение пяти минут при температуре 250 раз G при комнатной температуре. Затем отсадите среду, а затем повторно суспендируйте клетки в соотношении от 10 до 5 клеток на миллилитр в свежеприготовленном флуоресцентном растворе G актина Обратите внимание, что на 250 микролитрах биочернил печатаются три покровных листа с показанным здесь рисунком линий. После того как принтер будет включен и прогрет, поместите сюда нужную поверхность для печати, на центр ранее собранного столика используются накладки размером 22 миллиметра на 22 миллиметра.

Затем откройте программу для рисования и выберите нужный узор. Теперь нанесите пипеткой примерно от 100 до 120 микролитров клеточной суспензии в маленькую круглую лунку на дне отсека для картриджей. Распечатайте файл, когда принтер снова прогреется, картридж перейдет в положение готовности.

Когда картридж сдвинется немного левее, чернила хорошо капнут и останутся там. Потяните вверх за механизм подачи бумаги, начнется проволока и печать. Принтер печатает на обложке, расположенной в центре печатного столика, с помощью принтера HP Desk Jet 500 с биочернилами, состоящими из суспензии клеток фибробластов в растворе мономера G-актина.

Внутри принтеров серии HP 26 ячейки чернильных картриджей печатались на стеклянных крышках микроскопов. На этом рисунке показан репрезентативный результат печатных клеток фибробластов, которые демонстрируют инкорпорированные флуоресцентные актиновые мономеры. Этот шаблон был использован на предыдущем рисунке для создания непрерывной линии печатного раствора на большей части предметного стекла микроскопа.

На этом рисунке показана прямая линия, по которой биолинк и клетки взаимно осаждались. Следует отметить, что сразу после печати происходит увеличение фоновой флуоресценции, поскольку раствор биолинка, в котором суспендированы клетки, содержит свободный избыток флуоресцентных актиновых мономеров, инкубирующих клетки в течение примерно 10 минут после печати, облегчает адгезию к предметному стеклу, позволяя вымыть избыток раствора мономера с подложки свежей питательной средой, значительно снижая фоновую флуоресценцию. На этом репрезентативном изображении трех Т-трех фибробластов, напечатанных в локализованной зоне печати, как показано на этой флуоресцентной микроскопической микрофотографии клетки, сделанной через 15 минут после печати, гиин обозначен зеленым цветом, ядро — синим, а также наложение как актина ГИ, так и ядерного красителя.

На следующих двух изображениях показана флуоресцентная микроскопия двух фибробластов в виде линии через три часа после печати. На этом первом изображении показаны флуоресцентно меченые мономеры актина внутри клеток. Это второе изображение представляет собой наложение флуоресцентного канала на фоновое изображение, чтобы показать, что, хотя на слайде в нижнем левом углу может быть мусор, он не флуоресцирует.

Наконец, здесь представлена контрольная группа непечатных клеток, инкубированных в течение трех часов с мономерами с флуоресцентной мечкой, чтобы продемонстрировать, что мономеры не могут проникать через клеточную мембрану без проникновения через мембрану путем клеточной печати. При попытке выполнить эту процедуру важно очистить несколько картриджей и подготовить их к использованию, так как засорение принтера является одной из проблем, замедляющих этот метод. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как переоборудовать стандартный настольный принтер для печати живых клеток, что помогает создать переходную мембранную силу.