Определение оптимальной цитотоксической активности человека Her2neu специфических CD8 Т-клеток путем сравнения CR51 анализа высвобождения в системе xCELLigence

Общая цель следующего эксперимента — определить активность цитотоксических T-клеток путем сравнения метода на основе импеданса с использованием системы EXOGEN и анализа высвобождения хрома. Первый этап заключается в выделении мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) из цельной крови с помощью фиаля. Затем МКПК добавляют в лунки вместе с пептидным антигеном, рекомбинантным человеческим IL-2 и облученными МКПК для создания антигенспецифических CD8 T-клеток.

Затем антигенспецифические Т-клетки CD8 в обоих анализах культивируют совместно с опухолевыми клетками для индукции гибели последних. Полученные результаты демонстрируют процент лизиса опухолевых клеток, определенный с помощью метода импеданса и метода высвобождения хрома. Основным преимуществом данной методики перед существующими методами, такими как анализ высвобождения хрома, является то, что система на основе импеданса собирает данные в режиме реального времени и требует меньшего количества клеток, которые не нуждаются в маркировке. Для данного протокола в качестве источника PBMC (мононуклеарных клеток периферической крови) используется кровь здоровых доноров, положительных по HLA-A2, выделенная в соответствии с протоколом производителя.

Используйте F call PA plus для отделения P BMCs от крови. Затем в лунки шестилуночного планшета внесите примерно 4 миллиона P BMCs в двух миллилитрах среды на каждую лунку. В каждую лунку добавьте связывающий пептид HLAA two до конечной концентрации 10 µg/mL в культуре.

В альтернативные дни обновляйте среду, чтобы стимулировать экспансию T-лимфоцитов. Добавьте свежую среду, дополненную рекомбинантным человеческим IL-2 до конечной концентрации 50 units/mL. Через одну неделю подготовьте культуру аутологичных PBMC, облучите клетки и проведите пульсирование в течение двух часов с тем же HLA.

Стимулируйте повторно культуру, добавив в каждую лунку один миллилитр облученного аутологичного PBM CS с двумя связывающими пептидами в концентрации 10 µg/mL. Продолжайте добавлять свежую среду, дополненную IL-2, через день. По истечении еще одной недели повторно стимулируйте культуры таким же образом. После шести дополнительных дней культивирования клетки будут готовы к использованию.

Подготовьте станцию для измерения импеданса, уравновесив ее при температуре 37 °C в атмосфере с 5% carbon dioxide в течение как минимум одного часа. Соберите клетки опухоли человека с конфлюэнтностью 75%, используя 0.25% trypsin и центрифугирование. Подсчитайте количество опухолевых клеток с помощью гемоцитометра и ресуспендируйте их в среде RPMI.

Опухолевая суспензия в концентрации 7 500 клеток на микролитр. Далее в программном обеспечении xCELLigence настройте страницу макета с расположением лунок. На странице расписания установите интервал измерения импеданса каждые пять минут в течение 40 часов; при этом в первые 18 часов система xCELLigence будет измерять импеданс только опухолевых клеток.

Затем добавьте в каждую лунку по 100 µL среды RPMI для опухолевых клеток. Измерьте фоновые показатели на электродах (EPLs), замерив импеданс в отсутствие клеток. После добавления опухолевых клеток установите планшеты в станцию и начните снятие показаний.

Опухолевые клетки начнут прикрепляться к EPLs незамедлительно. Примерно через 18 часов инкубации опухолевые клетки прикрепятся к EPLs, и их количество в каждой лунке увеличится вдвое — до 15 000 клеток. В этот момент соберите подготовленные T-клетки с помощью аккуратного соскабливания и центрифугирования с перемешиванием.

Т-клетки ресуспендируют в среде RPMI с 10% FBS и подсчитывают с помощью гемоцитометра. После определения плотности клеток готовят серию двухкратных разведений Т-клеток таким образом, чтобы при добавлении 200 мкл Т-клеток к опухолевым клеткам максимальная концентрация составляла 40 Т-клеток на одну опухолевую клетку. Последнее разведение в серии должно обеспечивать 1,25 Т-клеток на одну опухолевую клетку.

Приостановите работу станции EXOGEN и удалите EPL с помощью пипетки. Удалите среду из лунок, затем внесите 200 µL T-клеток всех концентраций из серии разведений в качестве отрицательного контроля. Используйте чистую среду, верните EPL на станцию и по завершении анализа продолжите выполнение программы.

Нормализуйте результаты. При работе с хромом 51 и клетками-мишенями, меченными хромом 51, всегда соблюдайте установленные в учреждении правила радиационной безопасности и используйте экранирование для снижения воздействия радиации. Начните с импульсного мечения опухолевых клеток в течение двух часов при концентрации 1 миллион клеток на миллилитр, добавив 10 микколитров на миллилитр свежего хрома 51.

Затем промойте опухолевые клетки в 10 миллилитрах среды RPMI с 10% FBS, центрифугируйте их и ресуспендируйте в той же среде до концентрации 1 миллион клеток на миллилитр. Затем в 96-луночный планшет с круглым дном внесите по 100 000 опухолевых клеток в каждую лунку для определения спонтанного высвобождения.

В шесть лунок ничего не добавляйте, и так же поступите с еще шестью другими лунками. В все остальные лунки добавьте 100 µL Triton X 100 для лизиса клеток, чтобы рассчитать максимальный выход. Добавьте T-клетки в планшет, используя серию разведений, подготовленную ранее.

Теперь инкубируйте планшеты в течение пяти часов и соберите образцы супернатанта объемом 50 µL из каждой лунки; нанесите образцы на планшет Luma после высушивания планшетов в вытяжном шкафу в течение ночи при комнатной температуре. Измерьте их CPM с помощью гамма-счетчика. Раковые клетки T-клеток и SKBR3 культивировали на планшетах xCELLigence и измеряли индекс клеток, который отражает импеданс планшета, поскольку T-клетки не требуют адгезии для пролиферации.

Их влияние на импеданс в течение 40 часов культивирования было незначительным. В случае культивирования только раковых клеток наблюдалось увеличение показателей импеданса. Однако добавление Т-клеток через 18 часов нарушает эту тенденцию.

Данное событие требует нормализации программного обеспечения после добавления Т-клеток и будет далее исследовано в следующем эксперименте. При совместном культивировании клеток SK BR 3 с различными концентрациями Т-клеток снижение импеданса очень четко зависело от дозы Т-клеток; данные собирались каждые пять минут в течение трех повторов к 10-часовой отметке. Индексы клеток соответствовали полиному второй степени в диапазоне концентраций Т-клеток, что указывает на то, что станция Exogen в режиме реальногого времени регистрирует гибель опухолевых клеток SK BR 3, опосредованную CD8+ Т-клетками, в виде падения индекса клеток. Это было сделано, чтобы определить, было ли снижение импеданса SK BR 3 под воздействием Т-клеток антиген-специфичным.

Три клетки SK KBR культивировали совместно с HLA-A2-положительными FLU-специфическими T-клетками, которые не распознают HER2neu. Эти клетки проявляли значительно меньшую литическую активность. Чтобы дополнительно определить, уничтожают ли HER2neu-специфические T-клетки мишени антигенспецифическим образом, в сокультуры добавляли антитело к Fas-лиганду. Данное антитело не снизило литическую активность HER2neu P3609-специфических T-клеток.

Однако в случае с T-клетками, которые были неспецифически активированы бусинами с анти-CD3 и CD28, антитело ингибировало лизис. Чтобы определить, происходило ли уничтожение клеток зависимым от HLA I класса образом, в совместные культуры добавляли либо антитела к HLA I класса, либо изотипический контрольный антитело. Полученные результаты убедительно подтвердили эту гипотезу.

Затем Т-клетки культивировали совместно с другими раковыми клетками в соотношении один к пяти. В качестве отрицательного контроля использовали линию опухолевых клеток BT 20, негативную по HLA A2. Результаты показывают, что данный метод эффективен для различных типов адгезивных опухолевых клеток.

Сокультуры двух новых P 360 9-специфических T-клеток HER были добавлены к клеткам-мишеням, меченным хромом 51, с последующим проведением CRA-анализа. Данный метод анализа оказался более чувствительным для оценки согласованности. Внутрианалитическая вариабельность рассчитывалась как коэффициент вариации в процентах для каждого соотношения клеток в диапазоне от 1:40 до 1:5.

При самых низких соотношениях клеток этот показатель составлял менее 15%. Однако процентный коэффициент вариации (CV) был высоким или непредсказуемым. Кроме того, была изучена вариабельность лизиса T-клеток SK BR three при совместном культивировании с различными линиями T-клеток, специфичными к P 360 9.

Данные были получены с интервалом в 30 дней. Анализы проводились в трехкратной повторности, и результаты были очень схожими. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как определять активность цитотоксических Т-клеток, используя антигенспецифические CD8 T-клетки и опухолевые клетки с применением метода, основанного на импедансе.