Обнаружение токсинного транслокации в хост цитозоля от поверхностного плазменного резонанса

Общая цель данной процедуры заключается в обнаружении и количественном определении пула токсина, который проникает в цитозоль. Для этого сначала проводят связывание токсина с поверхностью клетки-хозяина при температуре 4 °C. Затем несвязанный токсин удаляют, и клетки нагревают до 37 °C, что позволяет токсину переместиться в эндомембранную систему и, в дальнейшем, в цитозоль клетки-хозяина; после проникновения токсина в клетку используют дигитонин для селективной пермеабилизации плазматической мембраны.

Клеточные экстракты разделяют на отдельные мембранную и цитозольную фракции методом дифференциального центрифугирования. В качестве заключительного этапа используется поверхностный плазмонный резонанс (сокращенно SPR) для обнаружения и количественного определения проникновения токсина в цитозоль путем перфузии цитозольной фракции через SPR-сенсор, покрытый антителами к токсину. Этот метод поможет ответить на ключевые вопросы в области биологии токсинов, такие как эффективность и кинетика проникновения токсина в цитозоль, количество токсина, попадающего в цитозоль, а также возможность ингибирования транспорта токсина в цитозоль с помощью лекарственных препаратов. Перед началом данного протокола подготовьте клетки HeLa для интоксикации, как описано в письменном протоколе, после инкубации клеток HeLa в течение ночи.

Замените культуральную среду на 1 мл DMEM, содержащего 100 нг/мл ганглиозида GM1, и инкубируйте в течение одного часа при 37 °C. Это увеличит количество мест связывания холерного токсина, так как рецептор GM1 токсина будет интерполировать в плазматическую мембрану клеток, подвергнутых воздействию раствора GM1.

После одного часа инкубации удалите среду из лунки GM 1 и дважды промойте клетки средой DMEM. Затем добавьте один миллилитр DMEM, содержащей 1 µg/mL холерного токсина, и выдержите клетки при температуре 4 °C в течение 30 минут. Удалите среду с токсином и дважды промойте клетки.

Затем инкубируйте клетки в 1 mL DMEM при 37 °C в течение необходимого времени. По окончании каждого периода вымывания промойте клетки раствором PBS, а затем инкубируйте каждую лунку с 250 µL 0.5 mM EDTA и PBS. После 10 минут инкубации на льду снимите клетки с 6-луночного планшета путем интенсивного тритурирования с помощью дозатора P 1000.

После сбора клеток из одной лунки объедините их с клетками из второй, а затем из третьей лунки той же группы. Затем поместите объединенную клеточную суспензию из трех повторностей в одну микроцентрифужную пробирку. Теперь центрифугируйте пробирку в настольной микроцентрифуге в течение пяти минут.

При центрифугировании с ускорением 5 000 ×g для всех условий должны быть получены клеточные осадки примерно одинакового размера. Удалите супернатант, затем ресуспендируйте клеточный осадок в 100 µL предварительно приготовленного и охлажденного 0,04% рабочего раствора дигитонина. Поместите клеточную суспензию на лед на 10 минут, затем с помощью настольной микроцентрифуги осадите пермеабилизированные дигитонином клетки, центрифугируя их при 16 000 ×g в течение 10 минут.

Перенесите супернатантную фракцию, содержащую цитозоль, в новую микроцентрифужную пробирку, а осадок, содержащий органеллы, сохраните. Стандарты токсина SPR готовят в концентрациях 110, 1 и 0,1 ng/mL в буфере HCN. Образцы готовят путем разбавления супернатантных фракций цитозоля в буфере HCN до конечного объема 1 mL. Объем образца должен составлять не менее 1 mL, чтобы обеспечить удаление воздуха из петли ввода объемом 500 µL перед инъекцией. Осадки, содержащие органеллы, ресуспендируют в 1 mL буфера HCN, содержащего 1% Triton X 100.

Добавление детергента необходимо для высвобождения пула токсина, заключенного в мембраны. Также подготовьте параллельные наборы цитозольной и органеллярной фракций для контрольного эксперимента с целью подтверждения точности процедуры фракционирования; ресуспендируйте цитозольную фракцию в 20 µL четырехкратного буфера для образцов, а органеллярную фракцию — в 120 µL однократного буфера для образцов. Разделите эквивалентные объемы каждой фракции с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия и проведите анализ методом вестерн-блоттинга, чтобы продемонстрировать распределение цитозольного белка в супернатанте и растворимого белка ЭПР в осадке. Для подготовки слайда SPR сначала установите в прибор SPR стеклянный слайд с золотым напылением и самособирающимся монослоем.

Активируйте сенсорный слайд, пропуская через него раствор E-D-C-N-H-S в течение 10 минут при скорости потока 41 µL/min. При всех последующих перфузиях используйте ту же скорость потока. Удалите буфер для активации E-D-C-N-H-S, промывая планшет в течение пяти минут раствором PBS, содержащим 0.05% 2020.

Теперь на планшете находятся реакционноспособные привязки MI благодаря снятию защитных групп раствором E-D-C-N-H-S. Далее в течение 15 минут проведите перфузию антител к CTA через активированный сенсорный слайд при разведении 1:20 000 в 20 мМ растворе ацетата натрия. Из-за изменения pH будет наблюдаться первоначальное падение единицы показателя преломления, сокращенно RIU.

За этим последует увеличение RIU по мере связывания антител с амидными реактивными связками. Затем удалите несвязавшиеся антитела с сенсорного слайда путем промывки PBST в течение пяти минут. Сигнал RIU, создаваемый связанными антителами, выйдет на плато и стабилизируется, обеспечивая новый базовый уровень сигнала.

В качестве завершающего этапа подготовки подложки ПЕРЕПОМПЛЫВАЙТЕ этаноламин 1 M через сенсорную подложку в течение пяти минут. Это позволит блокировать и инактивировать все несвязанные линкеры, оставшиеся на сенсорной подложке. Сигнал RIU вырастет; для установления базового значения перепомплывайте PBST через покрытую антителами сенсорную подложку в течение пяти минут.

Затем в течение 300 секунд проведите перфузию экспериментального образца или стандарта токсина над сенсором. Удалите лиганд из буфера и проведите перфузию PBST над сенсором еще в течение 200 секунд. Остатки токсина, сохранившиеся на сенсоре, удаляются с помощью 102-й промывки PBST при pH 5.0.

Это вернет сигнал к его начальному базовому значению, что позволит обработать другой образец на том же датчике. Перед загрузкой нового образца пропустите небольшое количество воздуха через петлю для образца, чтобы удалить остатки жидкости от предыдущего образца. После завершения сбора данных.

Данные можно анализировать с помощью программного обеспечения Scrubber 2, а для подготовки графиков можно использовать программное обеспечение Igor. Пертуссиновый токсин представляет собой AB-токсин, который перемещается с поверхности клетки в ЭР до того, как его A-цепь PTs1 попадет в цитозоль.

Метод анализа транслокации на основе поверхностного плазмонного резонанса (SPR) позволил обнаружить PT в цитозоле интоксицированных клеток CHO. В цитозоле неинтоксицированных клеток сигнал отсутствовал, что подтвердило специфичность антител к PT. Данное антитело не проявляло перекрестной реактивности с компонентами цитозоля клетки-хозяина.

Фракция цитозоля из клеток, интоксикация которых проводилась в присутствии фельдена. В случае A положительный сигнал также не был получен; BFA предотвращает транспорт токсина к месту транслокации в ЭР и, следовательно, доставку H-цепи в цитозоль. Chole toin является другим токсином AB-типа, транслоцирующимся в ЭР.

Субъединица CTA1 была обнаружена в цитозольной фракции клеток HeLa, обработанных CT. Это подтверждает, что данная методика работает с различными типами клеток и может быть применена к любому токсину, для которого существуют антитела к соответствующей цепи. Сигнал отсутствовал при пропускании цитозольной фракции клеток, обработанных CT, через SPR-сенсор, покрытый антителами к CTB; это доказывает, что, в отличие от субъединицы CT A1, связывающийся с клетками пентамер CTB не проникает в цитозоль.

После продувки сенсора SPR, покрытого антителами к CTA. Сигнал от органеллярной фракции выходит за пределы шкалы по сравнению с более слабым сигналом от цитозольной фракции. Это согласуется с известной низкой эффективностью транспорта CT к месту транслокации в ЭР, что, в свою очередь, ограничивает количество токсина, способного достичь цитозоля.

Также можно контролировать зависящее от времени накопление перемещенного в цитозоль токсина. После воздействия CT на клетки при температуре 4 °C токсин не обнаруживался в цитозоле через 15 минут после нагревания до 37 °C.

Небольшое количество цитозольного токсина было обнаружено через 30 минут при 37 °C, и постепенно большее количество цитозольного токсина обнаруживалось через 45 и 60 минут интервалов вымывания. Это свидетельствует о непрерывной долгосрочной доставке ассоциированного с клеткой токсина в цитозоль клетки-хозяина. Данный анализ также позволяет обнаружить ингибирование транслокации токсина в цитозоль: клетки, обработанные 10% DMSO, демонстрировали низкие уровни цитозольного CT1 по сравнению с необработанными контрольными интоксицированными клетками, что указывает на нарушение разворачивания токсина.

Наличие цепи является необходимым условием для транслокации в цитозоль, поэтому стабилизация CT A1, индуцированная DMSO, соответствующим образом предотвратила ее перемещение из ЭР в цитозоль. Для количественной оценки блока транслокации токсина, вызванного DMSO, была использована стандартная кривая, построенная по известным концентрациям токсина, чтобы рассчитать концентрацию CTA1 в цитозоле, которая составила 0,3 нг/мл для необработанных клеток и 0,1 нг/мл для клеток, обработанных DMSO. Таким образом, ингибирование разворачивания CT A1 с помощью DMSO привело к трехкратному снижению транслокации CTA1 из ЭР в цитозоль.

После выполнения данной процедуры мы сможем использовать другие методы, такие как тесты на интоксикацию, чтобы установить прямую связь между количеством токсина в цитозоле и его активностью.