Обнаружение инвазивный легочный аспергиллез в гематологических больных злокачественных новообразований с помощью бокового потока технологии

Общая цель данной процедуры — продемонстрировать использование устройства для латерального протока для экспресс-определения диагностического антигена Aspergillus в сыворотке крови и жидкости БАЛ человека. Это достигается путем первоначального нанесения образца сыворотки или БАЛ на порт подачи устройства для латерального протока. На втором этапе раствору дают возможность мигрировать вдоль мембраны.

Следующим шагом является определение достоверности теста путем изучения линии внутреннего контроля. Заключительным этапом является интерпретация результата теста путем изучения тестовой линии. В конечном итоге устройство для латерального протока используется для обнаружения диагностического антигена aspergillus в сыворотке крови или жидкости БАЛ.

Тест с использованием LFD на Aspergillus может применяться в качестве дополнительного метода диагностики инвазивного легочного аспергиллеза. Основным преимуществом данной методики перед существующими методами, такими как иммуноферментный анализ на Aspergillus, галактоманнан, анализ на панфунгал бета-глюкан и ПЦР-тест на Aspergillus, является то, что это экспресс-диагностический тест по месту оказания медицинской помощи, требующий минимального лабораторного оснащения и подготовки персонала. Хотя LFD был разработан для обнаружения видов Aspergillus, технология латерального потока может быть применена и для выявления других инфекционных патогенов, таких как виды Cestosporium, Fusarium и Rhizopus.

Поскольку в данном методе используются моноклональные антитела, специфичные к этим организмам, его визуальная демонстрация имеет решающее значение. Так как интерпретация результатов LFD требует ознакомления с форматом анализа, для получения сыворотки из необработанных образцов крови следует дать крови свернуться при температуре 4 °C. Сыворотку и жидкость бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) перед использованием следует хранить в виде аликвот при температуре -20 °C; хранение аликвотами ограничивает возможность деградации целевого антигена при многократном замораживании и оттаивании образцов во время повторного тестирования. Для подготовки образцов сыворотки и БАЛ к анализу разморозьте образцы при комнатной температуре, затем поместите их на лед, тщательно перемешайте с помощью вортекса и центрифугируйте в течение одной минуты при 14 000 об/мин. Для рутинного тестирования образцов человека разведите сыворотку в соотношении 1:1 со средой для культивирования тканей. В качестве альтернативы, чтобы диссоциировать целевой антиген из иммунных комплексов сыворотки, разведите сыворотку в соотношении 1:2 с PBS, содержащим 4% EDTA, нагрейте в течение трех минут на водяной бане при кипении и центрифугируйте в течение пяти минут при 14 000 об/мин.

Жидкости БАЛ человека не требуют предварительной обработки. Образец БАЛ, прошедший размораживание, перемешивание на вортексе и центрифугирование, представляет собой чистый образец, который можно наносить непосредственно на устройство для латерального потока. Для проведения анализа устройства для латерального потока или LFD хранят при комнатной температуре или 23 °C, при которой они стабильны в течение 12 месяцев.

Для начала анализа извлеките устройства из индивидуальных упаковок и поместите их на ровную поверхность. С помощью стерильного наконечника дозатора нанесите 100 µL предварительно обработанной сыворотки в порт для ввода устройства в течение нескольких секунд. Жидкость должна перемещаться за счет капиллярного эффекта по нитроцеллюлозной мембране в окне наблюдения.

Аналогичным образом нанесите 100 µL чистого образца БАЛ на выпускное отверстие устройства. Проведите анализ в течение 15 минут при комнатной температуре, после чего необходимо зафиксировать результаты теста. Время проведения теста до регистрации результатов не должно превышать 15 минут.

Поскольку это может привести к искажению интерпретации результатов, слабую реакцию не удастся усилить путем продления периода инкубации. LFD состоит из линии внутреннего контроля, обозначенной буквой C на пластиковом корпусе, и тестовой линии, обозначенной буквой T. Линия контроля должна появляться всегда, независимо от наличия антигена aspergillus в сыворотке крови или образце БАЛ. Это свидетельствует о правильном проведении анализа при наличии антигена aspergillus в сыворотке крови или образце БАЛ.

Тестовая линия также появится в течение 15 минут после нанесения образца. Интенсивность тестовой реакции на болезнь Лайма пропорциональна концентрации целевого антигена в образцах сыворотки и VAL. Наиболее сложным аспектом данной процедуры является интерпретация результатов теста.

Результаты LFD следует считывать через 15 минут и сравнивать их с представленным здесь характерным примером. На этом рисунке показаны характерные примеры слабых, положительных, умеренно положительных и сильно положительных результатов LFD для образцов БАЛ и сыворотки крови. Любая положительная тест-линия в образце сыворотки, независимо от интенсивности, указывает на инвазивный аспергиллез или заболевание IPA в связи с присутствием циркулирующего антигена aspergillus в кровотоке. Положительные реакции БАЛ, независимо от интенсивности, указывают на прорастание спор и развитие потенциально патогенных гиф в легких.

При отсутствии антигена aspergillus тестовая линия не появится, и результат регистрируется как отрицательный. В данной таблице представлены результаты LFD-тестов с использованием жидкости БАЛ от пациентов с острым миелоидным лейкозом или ОМЛ, диагностированных в соответствии с диагностическими критериями исследовательской группы Европейской организации по исследованию и лечению рака и Национального института аллергии и инфекционных заболеваний. В таблицу включены соответствующие клинические и психологические данные, а также результаты специфического ПЦР-теста ASPERIA для каждого пациента.

Согласно рекомендациям E-O-R-T-C-M-S-G 2002 года, пациентам 12, 13 и 16 был поставлен диагноз «возможный IPA» на основании факторов хозяина и клинических критериев или положительного результата теста на GM. Согласно пересмотренным рекомендациям E-O-R-T-C-M-S-G 2008 года, одних только факторов хозяина и положительного результата GM или одних только факторов хозяина и клинических критериев было бы недостаточно для указания на возможную инвазивную грибковую инфекцию, если они не сопровождались бы соответствующими подтверждающими данными клинических исследований и микологии. Пациенту шесть был поставлен диагноз «вероятный IPA» в соответствии с рекомендациями как 2002, так и 2008 годов в связи с наличием основных и второстепенных клинических признаков факторов хозяина, а также положительного результата теста на GM.

Наконец, следует отметить, что хотя в настоящее время ни метод LFD, ни метод ПЦР не включены в рекомендации E-O-R-T-C-M-S-G для анализа БАЛ-образцов пациентов шесть и 12, наблюдается высокая степень согласованности между этими двумя анализами и коммерческим тестом на галактоманнан, что указывает на присутствие антигена и нуклеиновой кислоты aspergillus после выполнения данной процедуры. Параллельно могут быть проведены другие методы, такие как иммуноферментный анализ на галактоманнан Platelia, панфунгальный тест на бета-глюкан или ПЦР-тесты на aspergillus, для подтверждения инвазивного грибкового заболевания. Не забывайте, что работа с сывороткой крови человека и жидкостью БАЛ может быть крайне опасной, поэтому операторы устройства должны быть вакцинированы от таких заболеваний, как гепатит B и туберкулез.