Фенотипический анализ и выделение мышей гемопоэтических стволовых клеток и Lineage, совершенных прародителей

В данном видео демонстрируется протокол выделения и фенотипической характеристики гемопоэтических предшественников с использованием сепарации на магнитных микросферах и сортинга клеток методом флуоресцентной активации. Сначала из мыши извлекают заднюю конечность, бедренную и большеберцовую кости, а также спинной мозг, после чего проводят гомогенизацию для получения суспензии клеток костного мозга. Затем данная популяция обогащается клетками, экспрессирующими C kit, с помощью потока магнитных микросфер.

Цитометрический анализ обогащенной популяции демонстрирует, что данный метод позволяет получать высокоочищенные клетки гемопоэтического ряда, предшественники и гемопоэтические стволовые клетки, которые в дальнейшем могут быть использованы для функциональных исследований in vitro и in vivo. Основным преимуществом данной методики перед существующими методами, такими как промывание костного мозга, является более эффективное и быстрое извлечение клеток костного мозга. Применение данного метода перспективно для терапии или диагностики воспалительных процессов, аутоиммунных заболеваний, иммунодефицитов, дегенеративных заболеваний, метаболических нарушений и иммунных моделей рака, поскольку он позволяет проводить фенотипическую характеристику и функциональный анализ гемопоэтических предшественников ex vivo.

Таким образом, данный метод позволяет проводить мониторинг гемопоэза при различных физиологических и патологических состояниях. Он также может быть использован для изучения передачи клеточных сигналов и регуляции экспрессии генов в ходе развития в различных подмножествах клеток-предшественников. Начните с того, что поместите эвтаназированную мышь в поддон из нержавеющей стали.

Обработайте область живота и спины 70% ethanol для сбора костей, которые будут использованы в качестве источника клеток. С помощью ножниц сделайте два небольших надреза на коже в области задних конечностей, с помощью пинцета вывихните бедренную кость, затем переверните мышь на спину и сделайте продольный разрез кожи. Для обнажения позвоночника удалите ткани, закрывающие его.

Затем с помощью остроконечных ножниц осторожно удалите все остатки мягких тканей с позвоночного столба. Используйте марлю, чтобы удалить остатки мягких тканей с бедренной и большеберцовой костей.

Затем поместите кости в коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую 30 мл дополненной среды RPMI. Положите несколько стерильных фильтров диаметром четыре пятых дюйма в стерильную ступку. Затем с помощью пинцета перенесите кости в ступку и накройте их еще одним слоем фильтров, чтобы создать поверхность для трения.

Затем поместите фильтр-сепаратор клеток с размером пор 40 мкм в коническую пробирку объемом 50 мл. После этого с помощью пестика измельчите кости до получения гомогенной клеточной суспензии. Затем с помощью пипетки перенесите суспензию в фильтр для клеток.

Затем добавьте в ступку пять миллилитров свежей дополненной среды RPMI, чтобы промыть и собрать оставшиеся клетки, перемещая жидкость пипеткой вверх и вниз. После этого перенесите среду RPMI в пробирку с фильтром. Повторяйте эти два последних действия до тех пор, пока гомогенизированные кости не станут прозрачными.

После того как раствор пройдет через фильтр, перенесите его в новую пробирку объемом 50 мл, повторно отфильтруйте и повторите процесс, чтобы удалить оставшиеся тканевые остатки. Центрифугируйте пробирку при 500 ×g в течение пяти минут при температуре 4 °C и осторожно удалите супернатант с помощью аспирации. Следите за тем, чтобы не потревожить осадок клеток.

Следующим этапом процедуры является характеристика фенотипов гемопоэтических предшественников. Начните с ресуспендирования клеточного осадка от каждой мыши в 15 миллилитрах PBS и 2%FBS. Затем центрифугируйте пробирку при 500 ×g в течение пяти минут при температуре четыре °C и аккуратно удалите супернатант путем аспирации.

Не задевайте осадок. Риз суспендировал осадок в 5 мл PBS с 2% FBS и подсчитал клетки с помощью гемоцитометра. После определения концентрации клеток перенесите 10⁵ клеток в каждую лунку 96-луночного планшета с круглым дном.

Затем центрифугируйте планшет при 500 ×g в течение пяти минут. Во время центрифугирования приготовьте в PBS с 2% FBS смесь моноклональных антител к перечисленным здесь поверхностным маркерам для окрашивания клеток. После завершения центрифугирования удалите супернатант, перевернув планшет, и добавьте по 50 µL смеси антител в каждую лунку.

Затем, используя многоканальный дозатор, произведите перемешивание путем пипетирования вверх-вниз до получения суспензии из отдельных клеток. Инкубируйте клетки в течение 20 минут в темноте при температуре 4 °C; после инкубации промойте клетки дважды 150 µL PBS с 2% FBS. Затем центрифугируйте планшет при 500 ×g в течение пяти минут.

Затем удалите сенну, перевернув планшет. Далее в каждую лунку добавьте 50 µL разведенного в 1:300 анти-P ketiga (размер семь) стрептавидина в PBS с 2% FBS; перемешайте путем пипетирования до получения суспензии из отдельных клеток. Инкубируйте клетки в течение 10 минут в темноте при температуре 4 °C.

Дважды промойте клетки 150 µL PBS и 2%FBS. После центрифугирования планшета удалите супернатант и ресуспендируйте клетки в 100 µL PBS и 2%FBS, затем проанализируйте образцы с помощью цитометрии. Далее, для сортировки выбранных субпопуляций гемопоэтических клеток, проводится магнитное обогащение костного мозга для выделения c-kit-положительных клеток. Ресуспендируйте клеточный осадок костного мозга, полученный как минимум от 10 мышей, в 1 мл буферного раствора, содержащего моноклональные антитела к c-kit, конъюгированные с PC в разведении 1:50.

После инкубации выдержите клетки в темноте при температуре 4 °C в течение 20 минут. Дважды промойте клетки 40 мл буферного раствора. После центрифугирования аккуратно удалите супернатант с помощью аспиратора.

Затем добавьте 50 µL микросфер anti A PC на одну мышь непосредственно к осадку. Тщательно перемешайте и инкубируйте в течение 20 минут в темноте при температуре 4 °C, после чего промойте и центрифугируйте клетки, как было описано ранее. Затем ресуспендируйте осадок клеток в 4 mL буферного раствора. Для каждых трех мышей установите колонки Max LS в магнитное поле подходящего сепаратора Max Separator.

Подготовьте колонки, промыв их четырьмя литрами буферного раствора. Затем нанесите суспензию клеток и соберите в приемную пробирку немаркированные клетки, прошедшие сквозь колонку. Промойте колонку буферным раствором трижды.

Добавляйте новый буфер по мере опустошения резервуара колонки. После того как весь раствор пройдет через колонки, слейте фильтрат, извлеките колонки из сепаратора и поместите каждую из них на 15-миллилитровую коническую пробирку. Пипеткой нанесите четыре миллилитра буферного раствора на каждую колонку, затем немедленно промойте магнитно меченные клетки, нажав на поршень в колонке.

Центрифугируйте пробирки при 500 ×g в течение пяти минут. Осторожно удалите супернатант с помощью аспирации. Ресуспендируйте каждый осадок в 1 мл буферного раствора и объедините осадки в одной конической пробирке объемом 15 мл.

После обогащения популяции c-kit-положительных клеток проведите окрашивание и сортировку клеток с помощью FACS. Гемопоэтические предшественники и гемопоэтические стволовые клетки из суспензии костного мозга, обогащенной c-kit-положительными клетками с помощью магнитных частиц, а также LT-HSC и THSC были отсортированы в соответствии с экспрессией поверхностных молекул, как описано в данном видео. На этом рисунке показан пример процедуры электронного гейтирования для идентификации общих лимфоидных предшественников как lin-.

Смотрите на клетки с низким уровнем экспрессии interleukin seven R. Lin-отрицательные, c-kit-положительные, sca-1-положительные и lin-отрицательные, c-kit-положительные, sca-1-положительные клетки из гейта c-kit-положительных клеток.

Общие миелоидные предшественники определяются как FC gamma R.Low CD 34-положительные клетки. Также из ворот C kit-положительных клеток гранулоцитарно-моноцитарные предшественники определяются как FC gamma R-высокие CD 34-положительные клетки, а мегакариоцитарно-эритроидные предшественники — как FC gamma R-низкие CD 34-отрицательные клетки. Из LKS восемь L-T-H-S-C и S-T-H-S-C определяются как CD 34-отрицательные и CD 34-положительные клетки соответственно. Таким образом, получены две обогащенные и высокоочищенные популяции, которые физиологически присутствуют в малом количестве, чтобы изучить влияние аутоиммунитета на гемопоэз HSC у контрольных мышей и мышей с воспалительным заболеванием кишечника.

Было проведено окрашивание антителами к KI 67 и DPI, как показано здесь. Циклирующие клетки в компартменте LKS CD 34 отрицательных гемопоэтических стволовых клеток здорового контроля практически не обнаруживаются. Напротив, при ВЗК наблюдается значительное увеличение того же подмножества клеток, и существенное количество ГСК обнаруживается в фазах S-G2 и M клеточного цикла.

Таким образом, можно предположить, что опосредованное Т-клетками хроническое воспаление определяет вступление HSC в клеточный цикл. Для оценки наличия TP, хранящихся в везикулах, CD34-отрицательные клетки здоровых мышей окрашивали нуклеотид-связывающим соединением хинином и ядерным красным красителем; анализ методом конфокальной микроскопии живых клеток показал, что в HSC, но не в GMP, в цитоплазме видны хинин-положительные везикулы. Чтобы определить, реагируют ли HSC на внеклеточный ATP, анализировали кальциевый ответ сортированных гемопоэтических стволовых клеток, нагруженных 4 0 2 и стимулированных ATP и иономицином, как показано здесь. Кривые повышения уровня кальция в отдельных клетках указывают на увеличение содержания цитозольного кальция в LT HSC при активации чистых анергических P2-рецепторов.

При воздействии TP, поскольку повышение уровня цитозольного кальция индуцирует высвобождение везикулярного A TP. Этот эксперимент позволяет предположить, что TP может регулировать собственное высвобождение из HSCs и демонстрирует, что данная процедура может быть использована для функциональных исследований HSCs. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как изолировать нейронные стволовые клетки и коммитированные предшественники линий для функциональных анализов. После выполнения этой процедуры можно провести другие методы, такие как реконституция необлученных мышей-реципиентов, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, о реконституционном потенциале гемопоэтических стволовых клеток, очищенных из C State или воспалительной среды.