Количественные Визуализация Lineage конкретных Toll-подобный рецептор-опосредованной сигнализации в моноцитах и ​​дендритных клеток из малых образцов крови человека

Общая цель следующего эксперимента — продемонстрировать использование технологии потоковой цитометрии с анализом изображений для количественной оценки клеточных механизмов первичных иммунных клеток из четко определенных когорт пациентов. Это достигается путем первоначального выделения мононуклеарных клеток периферической крови (pbmc) из образцов крови, полученных от пациентов или здоровых добровольцев. После выделения клетки активируют, а затем маркируют флуоресцентными метками.

Затем клетки подвергаются гидродинамической фокусировке, возбуждаются лазерным излучением и регистрируются с помощью ПЗС-камеры с интеграцией по времени задержки. На заключительном этапе выполняется сбор изображений с использованием проточного цитометра с регистрацией изображений и количественное определение NF kappa b.

Транслокация на каждом клеточном изображении выполняется с помощью программного обеспечения ideas. В конечном итоге различия между каждой группой испытуемых могут быть определены путем анализа точечных диаграмм, гистограмм и изображений клеток. Преимущество потока изображений заключается в том, что он объединяет фактические данные и иммунофлуоресценцию.

Мы можем изучать пути клеточной сигнализации с учетом специфики определенной линии клеток, будь то отдельная клетка или популяция, используя при этом лишь небольшой образец крови. Данный метод позволяет ответить на ключевые научные вопросы путем локализации и количественного определения промежуточных звеньев сигнализации. Например, его можно использовать для исследования опосредованного транслокации в ядро факторов транскрипции или для изучения влияния старения на биологию клетки.

Сотрудник моей лаборатории продемонстрирует технику после выделения мононуклеарных клеток периферической крови, полученных от добровольцев. Ресуспендируйте выделенные pBMC с концентрацией 3×10⁶ клеток на 0,6 мл среды, затем перенесите клеточную суспензию в пробирки объемом 1,5 мл. Далее часть клеток стимулируйте активирующим агентом, таким как TLR8-агонист R848, показанный здесь, после чего инкубируйте все клетки при 37 °C в течение 10–60 минут в инкубаторе с 5% CO2.

После периода инкубации осадите клетки центрифугированием в течение пяти минут при 500 ×g при комнатной температуре, удалите супернатант, проведите маркировку клеток коктейлем поверхностных антител, специфичных для линий моноцитов или дендритных клеток, в течение 20 минут при 4 °C, включая пробирки с клетками, маркированными одноцветными конъюгатами для использования в качестве контролей компенсации. Затем зафиксируйте клетки в 4% PFA в PBS в течение 10 минут при комнатной температуре. После центрифугирования клеток в течение 10 минут при 500 ×g при комнатной температуре ресуспендируйте PBMC в буфере для заморозки и храните клетки при -80 °C до дня проведения анализа.

Быстро разморозьте клетки на водяной бане при 37 °C, затем центрифугируйте их для удаления буфера для замораживания и пермеабилизируйте с помощью 100 µL буфера для промывки BD perm. Затем проведите маркировку антителами к внутриклеточным сигнальным компонентам, такими как антитела к NF kappa BP 65, показанные здесь, в течение 20 минут при комнатной температуре. После осаждения суспендируйте клетки в 100 µL буфера для промывки BD perm, содержащего козьи антитела к кроличьему IgG.

Alexa 6 47 и инкубируйте PBMC еще 20 минут при комнатной температуре. Непосредственно перед получением изображений проведите контрастирование ядер клеток ядерным красителем; начните с включения ImageStream, а затем запустите программное обеспечение Inspire. Далее нажмите «load default template» (загрузить шаблон по умолчанию), а затем выберите «initialize fluidics» (инициализировать гидравлическую систему).

Затем нажмите на меню галереи изображений и выберите все. Теперь нажмите «run set up», чтобы начать визуализацию микросфер, и выберите канал светлого поля. Когда микросферы будут в движении, нажмите «start all» во вкладке «assist» для калибровки и тестирования прибора.

После калибровки системы ImageStream нажмите «flush, lock and load», чтобы загрузить в прибор образец с наиболее интенсивным сигналом. Затем установите мощность лазера таким образом, чтобы для каждого флохрома максимальное значение пикселя на точечных диаграммах составляло от 104 000 единиц. После этого определите критерии классификации клеток.

Теперь нажмите run, затем acquire, чтобы собрать и сохранить файл с данными эксперимента. Для первоначального анализа данных откройте программное обеспечение Ideas Analytical. Создайте файлы с компенсированным изображением, а затем проведите гейтирование событий с нормальной интенсивностью окрашивания ядер и высоким коэффициентом формы ядер. Чтобы отличить одиночные клетки в гейте R1 от клеточного дебриса или многоклеточных агрегатов, определите моноциты в гейте CD14-положительных клеток; миелоидные дендритные клетки, характеризующиеся высокой экспрессией CD11c и низкой экспрессией CD4 и маркеров lin1, находятся в гейте R3.

Наконец, используйте программное обеспечение Ideas для определения колокализации цитоплазматического фактора транскрипции NF kappa B с ядерным красителем. Высокая корреляция NF kappa B и ядерного красителя, свидетельствующая о колокализации двух маркеров, отражается в высоком показателе сходства (similarity score) и указывает на степень активации клетки. Для оценки относительной функциональной эффективности клеток можно сравнить процент событий с высоким сходством между различными группами терапии или популяциями пациентов с помощью Ideas.

Затем с помощью программного обеспечения можно отобразить изображения клеток из ключевых сегментов гистограмм популяций. ImageStream позволяет осуществлять гейтирование субпопуляций клеток непосредственно из pbmc и визуализировать ответы клеток из гейтированных, но не сортированных популяций. В данном случае в исходном состоянии была количественно определена роль сигналинга TLR в ядерной локализации NF kappa BP 65 в lin one-отрицательных, CD four-димных, CD 11 C-положительных миелоидных dcs.

В большой части нестимулированных клеток транскрипционный фактор NF kappa BP 65 наблюдался в цитоплазме. После стимуляции в обработанных клетках был определен значительно более высокий показатель коинциденции NF Kappa BP 65 с ядерным красителем PI, что указывает на транслокацию NF Kappa BP 65 в ядро после стимуляции. На цифровых изображениях популяций необработанных клеток и клеток, стимулированных R 8 48, представленных при одновременном сборе данных, показаны репрезентативные клетки и интенсивность транслокации NF kappa B в ядро клетки. Обратите внимание на более высокую интенсивность окрашивания NF Kappa B и PI в группе, стимулированной R 8 48, по сравнению с необработанными клетками.

Мы применили данный метод к клеткам доноров разного возраста и выявили различия в путях активации NF kappa B, опосредованной TLR. После освоения эта методика может быть выполнена в течение одного дня (без учета дополнительного времени на анализ изображений), что позволяет получить как несколько изображений локализации, так и популяционную статистику. Кроме того, мы можем визуализировать ответы непосредственно от нескольких клеточных популяций без их физического разделения. Метод ImageStream может быть широко применен для изучения ряда клеточных механизмов и может оказаться весьма ценным в трансляционных исследованиях.