Подготовка Awake мыши для записи нервных реакций и инъекционных Трейсеры

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы записать ответы отдельных нейронов у бодрствующей мыши. Это достигается путем предварительного обезболивания мыши с помощью ингаляции изоофа фтора, помещения мыши в стереотаксическую рамку грызуна и обнажения черепа. Второй шаг заключается в том, чтобы определить интересующую область мозга с помощью стереотаксических координат и отметить эту область для последующей трепанации черепа.

Затем на череп устанавливается изготовленный на заказ головной столб, а головной столб помещается в монтажную планку, которая прикреплена к микроманипулятору на стереотаксическом аппарате. Последним шагом является выполнение трепанации черепа, чтобы позволить ввести электрод в мозг. Как только мышь восстанавливается после операции, ее удерживают в пенопластовом блоке.

Головной штифт помещается обратно в монтажную планку и прикрепляется к изготовленному на заказ стереотаксическому аппарату, а в мозг может быть вставлен микропипеточный электрод. Эта процедура позволяет изолировать отдельные единицы. Сильные реакции на стимулы могут быть зарегистрированы из одной и той же структуры мозга в течение нескольких дней, а следы могут быть использованы для изучения восходящих или нисходящих проекций в физиологически идентифицированные области или без влияния на реакции анестетиков.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами заключается в том, что на свойства отклика нейронов не влияют анестетики. Чтобы подготовить подголовник, сначала соберите изготовленную на заказ подголовник, просверлив отверстие в 15-миллиметровом стержне из нержавеющей стали длиной более 32 дюймов. Затем вставьте в отверстие перпендикулярно 20-миллиметровый роликовый штифт из нержавеющей стали.

Для формирования крестообразного вытачивания одним концом вертикального стержня принять винт под номером 1 72, как показано здесь. Далее подготавливаем монтажную планку. Это устройство состоит из более длинного латунного или алюминиевого стержня длиной около 90 миллиметров и шириной от пяти до 10 миллиметров, а также более короткого стержня длиной 15 миллиметров, который прикреплен к концу длинного стержня под углом 45 градусов.

Более короткий брусок имеет один паз, вырезанный в нижней части, и более короткий паз по ширине, который помещает в эти пазы верхнюю стойку, при этом перекладина прижимается к более короткому пазу. Монтажный блок представляет собой два куска алюминия, установленных вместе винтами для формирования блока размером примерно 30 миллиметров на 30 миллиметров на 25 миллиметров с вырезом для удержания монтажной планки, вставьте монтажную планку в вырез в монтажном блоке параллельно поверхности стола. Прикрепите монтажный блок к микроманипулятору так, чтобы положение головной стойки можно было точно разместить по средней линии и краям.

Наконец, отрежьте вольфрамовый стержень диаметром 0,01 дюйма примерно до пяти миллиметров в длину, согнув примерно один миллиметр под углом 45 градусов. Этот стержень служит заземляющим штифтом. После помещения животного в индукционную камеру с 5%-ным содержанием фтора убедитесь, что животное полностью обезболито, выполнив щипление пальца ноги и проверив отсутствие реакции.

После полного обезболивания поместите мышь в стереотаксическую рамку для грызунов, оснащенную адаптером для мыши, сначала поместив зубы внутрь отверстия прикусочной планки и осторожно затянув зажим для носа, пока он не прилегнет. Для того, чтобы животное оставалось под наркозом. Наденьте маску для лица, сделанную из куска латексной перчатки, на нос мыши и поддерживайте 5% изо фтора до тех пор, пока частота дыхания не составит примерно один вдох в секунду.

По истечении этого времени уменьшите изосодержание фтора до 1,5-2%Теперь закрепите голову, аккуратно поместив ушные стержни в каждый ушной канал. Стараясь не проколоть барабанную перепонку, зафиксируйте ушные дуги так, чтобы они плотно прилегали, но не проникали слишком глубоко в слуховые проходы. Подложите под мышь гелевую грелку.

Затем аккуратно нанесите офтальмологическую мазь, чтобы предотвратить пересыхание глаз. Используйте маленькую бритву или ножницы с тонкой точкой. Удалите шерсть между ушами вплоть до глаз.

Теперь очистите и простерилизуйте кожу головы с помощью скраба хлоргексидином или бетадином с последующим трехкратным спиртовым полосканием. Сделайте надрез по средней линии от затылка к глазам. При необходимости соскребите надкостницу до краев разреза скальпелем.

Осторожно втяните мускулатуру в задней части шеи с помощью щипцов, позволяя мышце разорваться вдоль слингов, чтобы свести к минимуму кровотечение. Нанесите гелевую пену под ткани кожи головы, чтобы свести к минимуму влагу и предотвратить движение кожи по черепу. Затем смочите аппликатор с ватным наконечником профильным спиртом isop и высушите поверхность черепа, чтобы усилить визуализацию достопримечательностей черепа.

Как только животное будет подготовлено, вставьте в него тонкий наконечник. Щуп, например, заточенный металлический стержень, вставьте в держатель электрода и прикрепите его к стереотаксическому микроманипулятору. Перемещайте зонд вперед и назад между bgma и лямбдой, следя за тем, чтобы латеральная медиальная координата для каждого местоположения отличалась не более чем на 50 микрон.

При необходимости аккуратно переместите голову с помощью амбушюр. Убедитесь, что дорсальная вентральная высота в Bgma и Lambda отличается не более чем на 50 мкм. Отрегулируйте высоту носового зажима, чтобы выровнять угол наклона черепа, при необходимости также может потребоваться отрегулировать высоту ушной планки.

Используйте атлас мозга мыши для определения координат интересующей цели относительно bgma. С помощью индийских чернил отметьте череп над целью, где будет сделана трепанация черепа. Сначала очистите череп, распределив стоматологический гель для травления по поверхности и потирая в течение примерно 10 секунд.

Затем промойте водой и полностью высушите. Далее нанесите на поверхность черепа адгезивный грунт для стоматологического цемента. С помощью аппликатора затем с помощью нового аппликатора распределите клей и отверждайте клей с помощью одного цикла ультрафиолетового пистолета.

Определите местоположение, расположенное дистальнее целевого участка. Для установки заземляющего штифта используйте наконечник скальпеля с мини-лезвием No 65, чтобы тщательно просверлить небольшое отверстие в черепе. На этом этапе отверстие должно быть достаточно широким для короткого конца заземляющего штифта.

Вставьте заземляющий штифт так, чтобы он упирался в мозговые оболочки. Убедитесь, что штифт ориентирован таким образом, чтобы он был направлен в сторону от bgma и места крепления головного штыря. Теперь переместите микроманипулятор так, чтобы стойка головы располагалась над bgma, касаясь черепа.

Основание головного столба должно лежать на черепе ровно. Затем с помощью диссекционных зондов нанесите небольшое количество стоматологического цемента вокруг головного столба и зашлифуйте штифт. Придавите цемент, чтобы обеспечить хороший контакт с черепом.

Затем отверждайте с помощью трех-четырех циклов с помощью ультрафиолетового пистолета. Наконец, нанесите второй раунд цемента, чтобы создать основание вокруг головного столба и закрыть канавки главного столба и вылечить нас. Прежде чем впервые найти контрольный знак трепанации черепа, который будет частично закрыт грунтовкой.

Затем с помощью скальпеля с мини-лезвием номер 65 разметьте квадрат три миллиметра на три миллиметра вокруг этого места. Нанесите каплю раствора лидокаина для снижения чувствительности. Теперь сделайте несколько надрезов с каждой стороны квадрата, стараясь не прорезать кость и не вонзить мозг.

Как только костный лоскут ослабнет, используйте кончик скальпеля, чтобы поддеть его, оставив твердую мозговую оболочку нетронутой. Затем покройте участок костным воском. После завершения операции выключите изофтор и освободите мышь от стереотаксической рамки.

Нанесите лидокаин на открытые участки кожи, а затем помазайте нео спорами, проведите послеоперационное обезболивание по указанию ветеринара и верните мышь в домашнюю клетку. Через 24 часа мышь можно использовать для электрофизиологической записи. Этот рисунок демонстрирует, что успешная установка головного поста позволяет экспериментатору записывать одиночные и многоединичные ответы бодрствующей мыши в течение нескольких дней.

Удерживающая система позволяет осуществлять стабильную электрофизиологическую регистрацию отдельных нейронов в мозге. Превосходная изоляция отдельных единиц и сильная реакция на стимулы могут быть зарегистрированы из одной и той же структуры мозга в течение нескольких дней. Например, у мыши с нижним холмиком в течение двух дней на левой панели показаны записи, полученные в первый день, а на правой панели — во второй день для оценки нисходящих проекций от слухового среднего мозга к слуховому стволу мозга, биотинилированные, декстер и амины, визуализированные с использованием дино бенадина, поскольку хромоген может быть введен в нижний холмик мыши, как видно здесь после электрофизиологической идентификации свойств нейронального ответа в месте инъекции. после обработки тканей.

Антероградное мечение в контралатеральном дорсальном кохлеарном ядре может быть визуализировано и построено на графике, как показано здесь, как показано здесь. Фотомикрофотографии с более высоким разрешением также могут быть получены для просмотра сильно меченых аксонов и терминалей. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как записывать свойства отклика отдельных нейронов и вводить красители или индикаторы для нейроанатомических исследований в бодрствующую мышь.

Этот препарат исключает влияние анестетиков на свойства нейронного отклика и позволяет проводить эксперименты в течение нескольких дней с одним и тем же животным. Ключом к процедуре является обеспечение надежного крепления головного столба к черепу и хорошей фиксации мыши. В то время как это видео иллюстрирует, как использовать эту процедуру для записи с отдельных нейронов в слуховой системе, с помощью этой техники можно изучить и другие области мозга.