Измерение давления в левом желудочке в позднем эмбриональных и новорожденных мышей

Общая цель данной процедуры заключается в измерении давления в левом желудочке (ЛЖ) у мышей на поздних стадиях эмбрионального развития и в новорожденном состоянии. Сначала подготавливается оборудование. Иглу, подключенную к датчику давления, необходимо совместить с ультразвуковым датчиком.

Затем подготавливают мышь и проводят ультразвуковое исследование ее ЛЖ. После этого иглу вводят в просвет ЛЖ и регистрируют показатели пульсирующего давления. В итоге, с помощью данной катетеризации жидкостным катетером под контролем УЗИ, определены показатели систолического давления у мышей на поздних стадиях эмбрионального развития и в раннем неонатальном периоде.

Основным преимуществом данной методики по сравнению с существующими методами, такими как использование сервопривода, отсутствие измерений давления или применение твердотельных катетеров, является возможность надежного и воспроизводимого измерения давления у мышей на поздних стадиях эмбрионального и неонатального развития. Как правило, лица, впервые применяющие данную методику, сталкиваются с трудностями из-за сложности поддержания ориентации эмбриона в эмбриональном пузыре, так как эмбрион имеет тенденцию к вращению. При использовании ультразвукового датчика, в зависимости от стадии развития исследуемой мыши, выберите подходящий датчик и заполните его дистиллированной водой.

Поместите датчик в регулируемую стойку ультразвуковой системы. Отрегулируйте стойку таким образом, чтобы обеспечить визуализацию левого желудочка (ЛЖ) в длинной оси мыши, закрепленной на платформе, при этом верхушка ЛЖ должна быть направлена в сторону рычага для инъекций. Система измерения давления состоит из заполненного жидкостью преобразователя давления, мостового усилителя, системы сбора данных и программы LabChart.

Для промывки трубок используется программный пакет и шприц объемом 20 мл, заполненный 10% гепаринизированным физиологическим раствором. Убедитесь, что в трубках или над преобразователем не осталось пузырьков воздуха. Трубки к преобразователю подключаются с помощью трехходовых кранов, люровых замков и штуцеров.

Откалибруйте систему датчика давления с помощью манометра, закрепив иглу, трубку и корпус в инъекционном плече. Замените манометр корпусом для фиксации трубки в инъекционном плече. В качестве корпуса используется модифицированный цилиндр шприца объемом 3 мл.

Закрепите датчик давления в кольцевом держателе. Расположитесь примерно на высоте платформы для визуализации, чтобы избежать засорения. Присоедините к трубке иглы иглу максимально возможного размера и введите гепаринизированный физраствор до появления нескольких капель.

Снова извлеките иглу. Убедитесь, что в трубках или над преобразователем не осталось пузырьков воздуха. Теперь нанесите порцию ультразвукового геля на платформу для визуализации.

Поверните иглу в корпусе трехмиллилитрового шприца так, чтобы скос иглы был направлен вверх. Затем с помощью регулируемого штатива осторожно выровняйте датчик так, чтобы иглу можно было продвинуть непосредственно в гель. Под центром визуализирующего датчика игла должна находиться достаточно низко, чтобы не проколоть кожух датчика, но достаточно близко, чтобы находиться в пределах глубины фокусировки датчика.

При необходимости иглу можно согнуть вручную так, чтобы она оставалась в правильной плоскости на протяжении всего хода. Сохраняя соосность, извлеките иглу и поднимите датчик визуализации, чтобы поместить мышь на платформу для визуализации. Замените иглу, прежде чем приступать к анестезии мыши.

Беременную самку мыши с установленным сроком или новорожденную мышь подвергают воздействию 1,5% изофлурана путем непрерывной ингаляции; для адаптации к маленькой голове новорожденной мыши в стандартный носовой конус можно вставить трубку. Новорожденных мышей фиксируют на платформе для визуализации ультразвуковой системы в положении лежа на спине (дорсальный декубитус), так что верхушка левого желудочка (LV) направлена в сторону манипулятора для инъекций. Для новорожденных мышей необходимо поддерживать температуру тела с помощью внешней тепловой лампы.

Беременные мыши требуют более тщательной подготовки. Нанесите ультразвуковой гель на конечности для обеспечения контакта с подключенным датчиком ЭКГ и контролируйте частоту сердечных сокращений. Введите ректальный термометр для получения данных обратной связи.

Контроль температуры тела. Удалите шерсть с живота с помощью депиляционного крема и промойте водой. Вскройте брюшную полость, используя диссекционные ножницы и изогнутый пинцет.

Выведите наружу один рог матки и поместите его на марлевую салфетку, смоченную теплым физиологическим раствором. На протяжении всей процедуры поддерживайте влажность всех эмбрионов и брюшной полости матери. Периодически добавляя теплый физиологический раствор, осторожно переместите эмбрион в подходящее положение для получения парастернального сечения левого желудочка (LV) по длинной оси. При использовании ультразвукового датчика для поддержания ориентации эмбриона можно использовать ватный тампон.

Проведите измерение давления во всех эмбрионах одного рога матки, прежде чем повторить этот процесс с другим рогом матки. Начните с нанесения предварительно подогретого ультразвукового геля Degas на эмбрион или новорожденную мышь. Опустите датчик и отрегулируйте угол наклона платформы для визуализации, чтобы получить оптимальное изображение длинной оси ЛЖ в парастернальной проекции.

Не изменяйте угол наклона датчика, так как это приведет к потере соосности иглы. Контролируя изображение ЛЖ на экране ультразвукового аппарата, медленно продвигайте иглу, пока она не окажется почти у основания датчика. При необходимости скорректируйте положение иглы и датчика, чтобы устранить смещение оси.

Изображение новорожденного мыши демонстрирует идеальную ориентацию левого желудочка, которой трудно добиться при работе с эмбрионом. Начните запись данных о давлении. Осторожно промойте иглу физиологическим раствором и закройте стоп-кран, ведущий к шприцу объемом 20 мл и к атмосфере.

Следите за давлением. Отрегулируйте настройки программы таким образом, чтобы на иглу воздействовало минимальное давление. Медленно продвигайте иглу до тех пор, пока она не станет видна на краю ультразвукового изображения, но еще не войдет в lv.

При необходимости скорректируйте положение иглы, чтобы ввести ее в LV через верхушку. При необходимости отрегулируйте положение датчика, чтобы обеспечить четкую визуализацию иглы. Введите иглу в просвет LV, регистрируя данные о давлении и контролируя положение иглы по ультразвуковому изображению.

Начало регистрации пульсовых колебаний от датчика давления подтверждает его нахождение в просвете ЛЖ. Если игла, по всей видимости, находится в просвете ЛЖ, но записи давления не имеют пульсового характера, промойте иглу, слегка нажав на plunger шприца, до момента обнаружения повышения давления. Объем промывочной жидкости должен быть минимальным, чтобы избежать изменения работы сердца во время измерения давления.

Если показания давления по-прежнему не пульсируют, игла может находиться выше или ниже нужной плоскости и не быть введенной в просвет LV. Вытяните иглу, промойте ее физиологическим раствором и введите снова.

Если пульсирующие показатели так и не были получены, перейдите к следующей мыши, обязательно используя новую иглу для каждого нового животного. Всю процедуру следует проводить как можно быстрее, чтобы свести к минимуму стресс для эмбрионов и новорожденных в течение всего эксперимента. Желудочковое давление мышей C 57 Black six J измеряли у мыши на стадии E 18.

Как и ожидалось, когда игла находилась вне левого желудочка (LV), давление было близко к нулю, а при введении иглы в LV у мыши в возрасте P 14 наблюдались пульсирующие показатели давления. Амплитуда пульсации давления была сглажена, так как величина давления была больше, а частота сердечных сокращений — выше. Частота сердечных сокращений определялась по частоте пульсации показателей давления для различных возрастов в диапазоне от E 18 до P 14.

Проводили измерения частоты сердечных сокращений и расчет систолического давления в левом желудочке. При выполнении данной процедуры важно не забывать периодически увлажнять эмбрионы и контролировать состояние матери. Этот метод открывает перед исследователями в области физиологии сердечно-сосудистой системы возможности изучения изменений артериального давления у развивающихся мышей.