Выделение молочной эпителиальные клетки трехмерных смешанных клеток сфероид Co-культуры

Общая цель данной процедуры заключается в выделении эпителиальных клеток из трехмерных смешанных культур тканей для анализа влияния стромальных фибробластов на биологию эпителиальных клеток. Это достигается путем предварительного создания трехмерных смешанных стероидных совместных культур. Затем сфероиды отделяют от матриксной культуры для выделения эпителиальных клеток после совместного культивирования.

Следующим этапом является пассирование эпителиальных клеток после совместного культивирования до тех пор, пока они не будут готовы к анализу. В конечном итоге влияние воздействия фибробластов в трехмерной культуре на поведение эпителиальных клеток можно оценить с помощью микроскопической визуализации культур и анализа результатов совместного культивирования. Для эпителиальных клеток это, например, флуоресцентная визуализация инвазии в матрикс и миграция в системе Transwell, как показано здесь. Процедуру продемонстрирует Куин, научный сотрудник моей лаборатории, который подготовил совместные культуры накануне.

Извлеките Matrigel из морозильной камеры и разморозьте его на льду в холодильнике при температуре 4 °C в течение ночи. В день проведения эксперимента поместите культуральную среду на лед минимум за один час до ее смешивания с Matrigel. Для разведения размороженного Matrigel.

Добавьте в стерильную пробирку на льду половину объема ледяной среды H Mac, необходимого для совместного культивирования. Затем добавьте в пробирку такое же количество размороженного матригеля для получения разведения один к одному, сохраняя пробирку на льду. После этого поместите по 50 µL смеси матригеля со средой в центр соответствующих лунок планшета на 24 лунки и инкубируйте планшет в инкубаторе при 37 °C с увлажненным воздухом и 5% CO2 в течение 10 минут.

Затем добавьте в лунки еще 450 µL смеси среды с Matrigel и инкубируйте в течение еще 60 минут. Во время второй инкубации подготовьте суспензию фибробластов и эпителиальных клеток в соотношении один к одному с концентрацией 0,5 × 10⁵ клеток в каждых 0,5 мл среды H me. После затвердевания смеси среды с Matrigel аккуратно нанесите суспензию клеток на поверхность геля и верните культуру в инкубатор на два дня.

Заменяйте среду каждые два-три дня, очень осторожно аспирируя среду с края лунки и аккуратно заменяя её свежей средой HEC; ежедневно контролируйте формирование сфероидов под микроскопом, используя при необходимости светловую или флуоресцентную микроскопию. Начните с того, что 10 раз перенесите культуру вверх и вниз с помощью стерильной стеклянной пипетки объемом 2 мл. Затем перенесите культуру стеклянной пипеткой в стерильную центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте в течение 10 минут при 350 ×g при комнатной температуре; после центрифугирования клеточный сфероид осядет на дне пробирки.

С помощью стерильного наконечника пастеревской пипетки осторожно удалите разрушенный матрикс-гель с поверхности центрифуги. Подготовка. Теперь добавьте 1 mL среды H mac к осадку, перемешав содержимое вверх-вниз два-три раза стерильной стеклянной пипеткой объемом 2 mL, и перенесите культуру в лунку 24-луночной пластины для культивирования тканей. Перед сменой среды дайте стероиду прикрепиться к поверхности лунки в течение как минимум 48 часов.

Со временем клетки покинут структуру сфероида и начнут расти в виде монослоев. После того как культуры клеток достигнут 50% конфлюэнтности, перенесите их, используя стандартный протокол, в чашку диаметром 35 мм на два-четыре дня, а затем в чашку диаметром 100 мм на три-пять дней перед дальнейшим анализом клеток. Используйте стерильную пастеровскую пипетку для аспирации среды, после чего вручную удалите как можно больше остаточных сфероидов. В трехмерных кокультурах сфероидов фибробласты с искусственно вызванным сайленсингом TM one, как показано здесь на рисунках D, E и F, индуцируют усиление инвазии матрикса эпителиальными клетками молочной железы по сравнению с контрольными фибробластами на рисунках A, B и C. Обратите внимание на эпителиальные выросты, проникающие в матрикс в сфероидах, содержащих фибробласты с сайленсингом TM one, что отмечено стрелками на рисунках D и F. Фибробласты с искусственной гиперэкспрессией TM one, показанные здесь на рисунках J, K и L, вызвали снижение инвазии линии клеток рака молочной железы SUM159 по сравнению с контрольными фибробластами на рисунках G, H и I; сравните отсутствие эпителиальных выростов в сфероидах, содержащих модифицированные фибробласты TM one, с теми, что содержат контрольные фибробласты, отмеченные стрелками на рисунках G и I, после создания кокультивируемых сфероидов.

Популяции клеток могут быть выделены из стероидов путем перепосева в двухмерном контексте. На этом композитном изображении представлены культуры, исследованные с помощью световой и флуоресцентной микроскопии после их выделения из культуры в матригеле. День ноль соответствует визуализации сразу после выделения; дни один, два и пять указывают на количество дней после выделения.

Обратите внимание, что количество клеток, покидающих этот стероид, увеличивается с течением времени. В конце концов остается «стероид-призрак» с очень малым числом клеток, на который здесь указывает стрелка. После удаления «призраков» и проведения пассажа остается очень мало стероидов.

В зависимости от относительных скоростей роста исследуемых клеток могут появиться чистые популяции в результате серийных пассажей или путем сортировки с использованием соответствующих клеточных маркеров. В данном примере образцы анализируют методом проточной цитофлуориметрии, используя зеленую и красную флуоресценцию для идентификации экспрессирующих GFP фибробластов и экспрессирующих mCherry эпителиальных клеток соответственно, чтобы определить относительную численность популяций эпителиальных клеток и фибробластов.

После выделения из 3D-сокультуры эпителиальные клетки сохраняют свойства, приобретенные в результате совместного культивирования с фибробластами, в течение длительного времени, что предоставляет широкие возможности для анализа. В данном примере воздействие фибробластов с дефицитом TM one индуцировало усиление миграции в сокультивируемых H max, которое сохранялось в течение нескольких недель после выделения из 3D-сокультуры по сравнению с воздействием контрольных фибробластов, обозначенных здесь как C, после выполнения данной процедуры. Для ответа на дополнительные вопросы о влиянии фибробластов на эпителиальные клетки могут быть применены и другие методы, такие как анализ изменений в экспрессии генов и эпигенетических метках.