TransFLP - метод генетической модификации Холерный вибрион На основе природных преобразований и FLP-рекомбинации

Целью этой процедуры является генетическое манипулирование vio cray с помощью этого быстрого и несовершенного метода, который основан на естественной трансформации и комбинации переворота. Это достигается путем предварительной подготовки правильного источника хитина, поскольку хитин является естественным индуктором трансформации. На втором этапе с помощью двух раундов ПЦР генерируется конструкция ДНК и выполняется их естественная трансформация, позволяющая плазмидному PBR флипу, содержащему бактерии, занять фрагмент ПЦР и включиться в их геномы.

Затем используется повышенная температура, чтобы индуцировать фермент липазу, кодируемый плазмидой, для удаления мишени перевернутой рекомбинации или фланкированной кассеты устойчивости к антибиотикам с сайтом FRT. На заключительном этапе бактерии излечиваются от плазмиды, кодирующей FLP. В конечном счете, ПЦР и секвенирование используются, чтобы показать, что генетическая манипуляция была успешной.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как использование плазмид самоубийства для генетической манипулирования вирусами, заключается в том, что этот метод очень быстрый и эффективный. Начните с взвешивания от 50 до 80 миллиграмм образцов хитиновых хлопьев в стандартных пластиковых пробирках объемом 1,5 миллилитров, затем, держа крышки открытыми, автоклавируйте хлопья после вызова автоклава, немедленно закройте крышки и храните набор автоклава в хлопьях при комнатной температуре, требуется не менее шести олигонуклеотидов для амплификации интересующих участков ДНК, а также фланкированная кассета с антибиотиками FRT методом ПЦР. Также рекомендуется включить пару олигонуклеотидных праймеров за пределами вставленного фрагмента ПЦР.

Это позволяет с осторожностью проверить интеграцию и правильное иссечение фланкированной конструкции кассеты с устойчивостью к антибиотикам FRT, олигонуклеотидов номер два, номер три, номер четыре и номер пять. Второй и пятый праймеры должны содержать, по меньшей мере, 28 пар оснований, чтобы иметь возможность в достаточной степени встать на колени к геномной ДНК и праймерам. Третий и четвертый должны быть сконструированы с помощью FRT и FRT, содержащего плазмиду в качестве шаблона дизайна праймеров два и пять, чтобы обеспечить обширное комплементарное спаривание оснований на пяти основных концах между праймерами 2 и 3 и праймерами 4 и 5 соответственно.

Теперь для первого раунда ПЦР используйте олигонуклеотиды 1 и 2 для приготовления первой из трех одновременных, но независимых ПЦР-реакций для амплификации начальной области экспериментальной области, представляющей интерес для специально разработанных конструкций. Параллельно готовят вторую реакцию ПЦР с использованием олигонуклеотидов 3 и 4 для амплификации фланкированной кассеты антибиотиков FRT. Например, в этом эксперименте использовался ген A PH, кодирующий устойчивость к канинам.

Одновременно амплифицируйте нижележащую область ДНК путем подготовки третьей ПЦР-реакции с использованием олигонуклеотидов 5 и 6 и геномной ДНК в качестве матрицы. Затем начать реакцию ПЦР для всех трех образцов после очистки всех трех фрагментов ПЦР, использовать смесь с равными количествами всех трех фрагментов, полученных в первом раунде, в качестве шаблона для выполнения второго раунда ПЦР. Эта амплификация будет катализироваться олигонуклеотидами 1 и 6.

Полученный фрагмент ПЦР будет служить трансформирующей ДНК в экспериментах по естественному превращению. После выращивания v холерных клеток, аэробно обогащают среду при 30 градусах Цельсия. Соберите бактерии путем центрифугирования при комнатной температуре.

Затем перенесите бактериальную культуру на воздушный змей в виде хлопьев и инкубируйте клеточную суспензию в течение ночи при температуре 30 градусов Цельсия. Затем тщательно перемешайте не менее 200 нанограммов фрагментов, полученных методом ПЦР второго раунда, с суспензией бактериальных клеток. Следя за тем, чтобы бактерии не отделились от поверхностей хитина, затем инкубируйте этот раствор при температуре 30 градусов Цельсия без движения в течение еще одного дня.

Теперь в вихревом состоянии культура энергично в течение не менее 30 секунд для бактерий, которые являются носителями плазмиды PBR flip, распределяет от 100 до 300 микролитров клеточного раствора на двойные селективные планшеты, содержащие ампициллин. В дополнение к другому антибиотику в планшетах, инкубируйте бактериальные клеточные культуры при температуре 30 градусов Цельсия до тех пор, пока не станут видны колонии. Затем изолируйте одиночные трансформаторы от селективных пластин.

Начните этот шаг с выращивания бактерий на агаровых пластинах LB, содержащих ампициллин, при температуре 37 градусов Цельсия в течение 16-24 часов. В качестве дополнительного шага измените температуру на два-три часа до 40 градусов по Цельсию, поскольку выражение флипа от плазмиды PBR флип подавляется при более высоких температурах. После еще восьми часов инкубации при 37 градусах Цельсия перенесите бактерии в свежие тарелки.

Теперь ограничьте клоны параллельно на агаровых планшетах, содержащих антибиотики и не содержащих антибиотики, чтобы проверить чувствительность к антибиотикам, а затем выделите одну получившуюся колонию, чувствительную к антибиотикам. Начните этот этап с выращивания культуры в течение ночи в аэробных условиях при 30 градусах Цельсия, обогащайте среду без антибиотиков. На следующее утро выращивайте новую культуру в течение трех-шести часов, разбавляя ночную культуру в соотношении один к 100 в свежей среде, не содержащей антибиотиков, во второй половине дня или разбавляя культуру планшетами на простых пластинах с агаром LB, а затем инкубируйте пластины еще от восьми до 16 часов при температуре 30 градусов Цельсия до тех пор, пока колонии не станут видимыми.

В этом первом эксперименте было направлено удаление соседних генов CTXA и CTXB. Олигонуклеотиды для метода trans flip были получены, как только что было продемонстрировано: родительский штамм, промежуточный штамм, содержащий фланкированную кассету с антибиотикорезистентностью FRT, вместо исходного локуса ДНК C-T-X-A-B, и окончательный штамм, удаленный для C-T-X-A-B и освобожденный от кассеты резистентности, были протестированы на их генотип. но только к хромосомной ДНК. Фрагменты ПЦР разделяли с помощью стандартного аэрогелевого электрофореза для определения их размера.

На первой полосе мировой штамм холеры типа B был локализован при ожидаемом размере фрагмента в 3 143 пары оснований. На втором дорожке фрагмент ПЦР, полученный из штамма дельта C-T-X-A-B-F-R-T, может. FRT располагался на 3 162 парах оснований.

А на третьей полосе фрагмент delta ctx A B FFR TP CR был расположен на 1 769 парах оснований по сравнению с одной лестницей KB. Во втором примере, в котором был удален целый геномный островок, в качестве мишени для этого эксперимента был выбран остров патогенности вибриона или VPI. Метод транс-флипа был модифицирован в два этапа.

Во-первых, интеграция гена резистентности к канамицину была продолжена с помощью одного сайта FRT в начале PI. Затем был проведен второй раунд естественной трансформации, позволяющий ввести дополнительный маркер устойчивости к антибиотикам, а именно резистентность к гентамицину, за которым последовал второй сайт FRT в конце острова патогенности. Соответствующие пары праймеров указаны над каждым изображением геля, и метод trans FLP был продолжен, как показано выше.

Родительский, промежуточный и конечный штаммы были верифицированы с помощью ПЦР очищенной геномной ДНК в первой полосе. ПЦР-фрагмент дикого штамма холеры V типа был проведен на второй дорожке. Проведен фрагмент ПЦР, полученный из штамма VPI one FRT может GM FRT.

А на третьем дорожке был проанализирован продукт ПЦР, полученный из штамма дельта VPI one FRT. Пары праймеров указаны над каждым изображением геля. В последнем штамме отсутствует весь VPI.

В этом третьем примере полимеразно-зависимая последовательность промотора A T 7 РНК была интегрирована вверх по потоку с геном T fox, основным регулятором естественной трансформации с использованием метода trans flip с небольшой модификацией по сравнению со стандартным протоколом. Консенсусная последовательность Т-7 РНК-зависимого промотора была включена в качестве выступов в олигонуклеотиды номер четыре и номер пять, так что эта последовательность ДНК сохранялась в пределах хромосомы. Даже после того, как кассета с устойчивостью к антибиотикам была вырезана, конструкция была интегрирована в полимеразу Т-7 РНК, содержащую окрашенный штамм V.

В этом штамме экспрессия гена РНК-полимеразы T seven была обусловлена промотором LAC UV five для тестирования зависимой экспрессии полимеразы T Seven РНК T Fox Анализы естественной трансформации были проведены в среде LB. Родительская линия, лишенная зависимого промотора T 7, предшествующего гену T Fox, не может быть естественно трансформирована в этих условиях из-за отсутствия транскрипции T FOX в богатой среде и отсутствия его естественного индуктора хитина. Этот фенотип не зависел от того, была ли РНК-полимераза Т-7 искусственно индуцирована IPTG или нет.

Тем не менее, штамм, сгенерированный трансфлипом, который содержит промотор полимеразы Т-7 РНК выше компетентного гена Т-Фокса, действительно является естественно трансформируемой средой обогащения из-за утечки промотора LAC UV 5 в среде LB. Полученная Т-7 РНК-полимераза уже транскрибировала T FOX из Т-7 РНК-зависимого промотора без индукции ИПТГ. Это положило начало естественной компетентности и трансформации, подтверждающей функциональность интегрированной полимеразной промоторной последовательности Т-7 РНК.

Этот фенотип был значительно усилен за счет полной индукции РНК-полимеразы Т-7 за счет добавления индуктора промотора LAC UV 5 IPTG. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как генетически манипулировать VI холерой с помощью комбинации естественной трансформации, вызванной хитином, и рекомбинации флипа. После освоения этот метод позволяет удалять гены или геномные островки, а также интегрировать последовательности ДНК сайт-направленным образом всего за несколько дней.