Изучение митоза Checkpoint, иллюстрируя динамического поведения белков кинетохора и хромосомы движения в живых Drosophila Синцитиальный эмбрионов

Целью данного эксперимента является демонстрация визуализации динамики белков in vivo и закономерностей локализации в живых эмбрионах дрозофилы с помощью покадровой конфокальной микроскопии. Это достигается путем первого сбора эмбрионов из поддерживаемых запасов дрозофил. Затем перенесите эмбрионы на предметное стекло, а затем вручную удалите кунов с эмбрионов на эмбрионы с покрытием.

Впоследствии они организованно монтируются на заранее подготовленные предметные стекла и, в зависимости от эксперимента, могут быть микроинъекции с соответствующими реагентами, вызывающими контрольные точки веретена. Заключительным этапом этой процедуры является проведение покадровой визуализации эмбрионов с помощью конфокальной микроскопии. В конечном счете, покадровая и фокальная микроскопия используются для демонстрации белка контрольной точки веретена, поведения хромосом колокализации и влияния агентов, индуцирующих контрольные точки, в трансгенных линиях OPH, связанных с контрольными точками.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области регуляции МЭ, такие как влияние мутаций или истощения белка контрольной точки веретена посредством использования генных линий на колокализацию других компонентов контрольных точек, и последствия этого на способность контрольной точки сборки веретена эффективно функционировать. Трансгенные мухи содержатся при температуре 25 градусов Цельсия в пластиковых флаконах, содержащих корм для мух, и с дополнительным сухим дрожжевым порошком сверху. Флакон регулярно заменяют каждые две-три недели, в зависимости от условий выращивания.

Чтобы приготовить корм для мух, нагрейте соответствующее количество смеси для мух при постоянном помешивании для растворения компонентов с помощью перистальтического насоса, распределите от восьми до 10 миллилитров этой среды в виде кашицы в каждый пластиковый флакон. Когда пищевая суспензия застынет и наберет температуру струны, закупорьте каждый флакон пробкой из хлопчатобумажного пенопласта. Поместите эти флаконы с едой в лоток, запечатайте в полиэтиленовый пакет и храните при температуре четыре градуса Цельсия для небольшого сбора яиц.

Переложите около 50 пар двух-трехдневных взрослых мух в флакон со свежим кормом для мух, снабженный дополнительным сухим дрожжевым порошком на его поверхности для кладки эмбрионов. Инкубируйте при температуре 25 градусов по Цельсию, что в данном случае является температурой, поддерживаемой кондиционером. Для помещения каждый час перекладывайте мух в свежую пилку и оставляйте эмбрионы на 30 минут.

Чтобы убедиться, что часть собранных эмбрионов бушевала вокруг ядра цикла с восьмого по десятый. Сбор в течение первого часа обычно выбрасывается, так как он часто содержит состаренные эмбрионы, которые сохранились в женских телах, когда условия не были пригодными для кладки. Таким образом, в этих экспериментах будут использоваться только эмбрионы, полученные после переноса на второй час и далее.

Для этой процедуры используются предметные стекла микроскопа и защитные стекла размером 50 на 22 миллиметра. Начните с того, что возьмите чехол и влажной кистью для тонкого пера слегка смочите четыре угла с одной стороны очень небольшим количеством воды. Поместите защитное стекло на предметное стекло микроскопа.

Поверхностное натяжение капилляров, вызванное тонкой жидкой пленкой, должно препятствовать смещению крышки. Нанесите тонкую полоску гептанового клея на середину покровного листа. Гептан должен испариться за считанные секунды, оставив клей на покровном листе.

Затем с помощью алмазной ручки разрежьте еще одну покровную ручку на небольшие квадраты площадью около 1,5 миллиметра. Возьмите один квадрат и положите его на один конец клеевой полоски. Это будет использоваться для вскрытия кончика иглы, когда требуется микроинъекция.

Возьмите еще одно предметное стекло микроскопа, воткните к нему двухсантиметровый кусок двустороннего скотча и снимите с покровной бумаги, чтобы начать процедуру покрытия эмбрионов. Переложите мух в пузырек со свежими продуктами с помощью влажной и тонкой кисточки для пера. Переложите около 50 яиц на двустороннюю липкую ленту на подготовленное горло.

Используйте соответствующее количество жидкости, чтобы яйца могли разложиться. Когда жидкость испарится, яйца прилипнут к ленте под препарирующим микроскопом. Осторожно коснитесь яиц несколько раз вдоль их длинной оси внешней стороной одной половины пинцета, пока кориан не сломается и не раскроется.

Оставьте зародыш в скорлупе кориана, чтобы предотвратить быстрое обезвоживание. Продолжайте этот процесс до тех пор, пока не будет обработано от 10 до 20 яиц. Далее поднимите зародыши и выньте их из скорлупы кориана по одному и аккуратно поместите зародыши в вертикальную полоску.

На клей полоска. Выровняйте зародыши длинной стороной антипараллельно длинной стороне клеевой полоски. Поместите эмбрионы в камеру для высыхания на три-восемь минут.

Наконец, накройте эмбрионы соответствующим количеством теннисного масла Volter, чтобы предотвратить чрезмерное обезвоживание перед микроинъекцией. Микроприем внутрь является самым сложным аспектом этой процедуры. Для того, чтобы сделать микроприем внутрь максимально простым и эффективным, следует следовать специальному протоколу для небольшого приготовления.

Эмбрионы должны быть тщательно подготовлены, чтобы они были в оптимальном состоянии для микропроглатывания. Иглы для микроинъекций эмбрионов подготавливаются заранее. С помощью наконечника для тонкой загрузки заполните иглу одним-двумя микролитрами реагента соответствующей концентрации в буфере для инъекций.

Установите иглу в иглодержатель на двухинвертированный конфокальный микроскоп Leica TCSP с напорной трубкой, подключенной к системе управления впрыском. Найдите эмбрион в пределах целевого показателя 40 раз. Далее найдите тень иглы, не меняя фокальную плоскость.

Это достигается путем перемещения иглы в центр поля зрения и постепенного опускания ее в правую фокальную плоскость. Очень осторожно переместите предметный столик микроскопа, чтобы найти небольшой квадрат защитного стекла, установленный на одном конце клеевой полоски. Очень осторожно перемещайте кончик иглы до тех пор, пока он не коснется края небольшой квадратной крышки и аккуратно разомкнется.

Сдвиньте ступень так, чтобы эмбрионы снова появились в поле зрения, и выберите эмбрион в нужном возрасте для инъекции. Осторожно переместите эмбрион близко к игле и отрегулируйте фокальную плоскость как для эмбриона, так и для иглы. Переместите эмбрион в иглу.

Введите каплю реагента в сторону эмбриона, а затем отодвиньте эмбрион в сторону. Покадровая съемка или одиночные изображения живых эмбрионов собираются с помощью двухинвертированной конфокальной микроскопической системы Leica TCSS SP с 40-кратным масляным иммерсионным объективом. При визуализации нескольких флуорофоров, которые имеют перекрывающиеся спектры и совместно экспрессируются в одном и том же эмбрионе, каждая длина волны излучения флуоресцентного белка собирается последовательно.

Изображения появились позже, когда были установлены временные рамки для покадровой съемки. Эти факторы необходимо учитывать. Одно изображение обычно получается в среднем из двух строк сканирования.

При среднем двухкадровом сканировании требуется минимум 6,3 секунды для сканирования изображения размером пять 12 на пять 12 пикселей в режиме одновременного сканирования и 15,44 секунды для последовательного сканирования и получения хорошего соотношения сигнал/шум. Отверстие обычно устанавливается на один-два au или воздушное устройство, а мощность лазера регулируется до минимально возможного уровня, чтобы избежать значительного фотообесцвечивания. В этом репрезентативном фильме показана динамическая рекрутация кинетического ядра CDC 20 и движение хромосом у живых яцеклеток в циальных эмбрионах.

Покадровая съемка была сделана с трансгенного первичного эмбриона, экспрессирующего G-F-P-C-D-C 20, показанного зеленым цветом, и его камня 2 B, показанного красным. Во время циклов деления ядра каждые 10 секунд бралось от семи до восьми кадров, и кадр с клетками, уже находящимися в профазе, рассматривался как нулевая временная точка. На этом рисунке показаны кадры из покадрового фильма G fp: CDC 20 можно легко наблюдать на профазе и прометафазной кинетике, как показано белыми стрелками на изображениях 3 и 4 соответственно, и сохраняется на метафазном и анафазном кинетте, как видно на изображениях 5 и 6 соответственно.

G-F-P-C-D-C 20 исключается из ядра интерфейса, обозначенного белой стрелкой на первом изображении, и входит в ядро путем ранней профазы, как показано на втором рисунке. На изображениях от 8 до 14 морфологий хроматина определяли с использованием коэкспрессированных RFP-гистонов двух B в качестве слитых маркеров. Изображения показаны в нижнем ряду.

Используя этот протокол, контрольную точку сборки веретена или функции SAC можно изучить, манипулируя эмбрионами путем микроинъекции антител, флуоресцентно меченных белков или представляющих интерес химических соединений, которые потенциально запускают SAC. В этом примере эмбрионы с помощью колхицина деполимеризуют микротрубочки, тем самым провоцируя SACG FP CDC 20 или GFP MAD. Два сигнала кинетического ядра были использованы в качестве маркеров прогрессии клеточного цикла.

На верхней панели ARES указывают на задержанные эски на изображениях со второго по шестой. Область, отмеченная стрелкой на первом изображении, указывает на то, что до обработки колхицином G-F-P-C-D-C 20 был исключен из позднего ядра интерфейса. Изображения на средней панели показывают, что в отсутствие эндогенного MAD два G-F-P-C-D-C 20, обозначенные стрелками от 7 до 12, продолжают колебаться внутрь и из ядра, а также вверх и вне кинетического курса.

Несмотря на то, что цитокинез является дефектным, это указывает на нарушение функции SAC в арестантных клетках в ответ на лечение колхицином. Пример неудачного отделения дочернего ядра показан на рисунке 10. Наконец, на нижней панели стрелки на изображениях с 14 по 18 указаны кинетические ядра с накопленными гибридными белками GFP MA two, что позволяет предположить, что функциональный GFP MA two спасает фенотип дефекта мешка в мутантном эмбрионе MA two.

Стрелка на рисунке 13 указывает на накопление GFP MAD two в ядре поздней границы. После просмотра этих видео у вас должно быть хорошее понимание того, как собрать два программных эмбриона из поддерживать стебли, вручную декоординаторировать эмбрионы перед подготовкой слайдов для микроприема с выполнением in vivo время, оставленной визуализацией с помощью конфокальной микроскопии.