Изучение митоза Checkpoint, иллюстрируя динамического поведения белков кинетохора и хромосомы движения в живых

Целью данного эксперимента является демонстрация визуализации динамики белков и паттернов их локализации in vivo в живых эмбрионах дрозофилы с помощью конфокальной микроскопии в режиме тайм-лапс. Для этого сначала собирают эмбрионы из поддерживаемых линий дрозофилы. Затем эмбрионы переносят на предметное стекло, после чего вручную удаляют хорион с эмбрионов до получения очищенных эмбрионов.

Затем образцы организованно наносятся на предварительно подготовленные предметные стекла и, в зависимости от эксперимента, могут быть подвергнуты микроинъекциям соответствующими реагентами, индуцирующими контрольную точку веретена деления. Заключительным этапом данной процедуры является проведение таймлапс-визуализации эмбрионов с помощью конфокальной микроскопии. В конечном итоге таймлапс- и фокальная микроскопия используются для демонстрации белков контрольной точки веретена, колокализации, поведения хромосом, а также воздействия агентов, индуцирующих контрольную точку, в трансгенных линиях oph, связанных с контрольной точкой.

Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области регуляции ME, такие как влияние мутаций или делеций белков контрольной точки веретена деления (с использованием генетических линий) на колокализацию других компонентов контрольной точки, а также последствия этого для способности контрольной точки сборки веретена функционировать эффективно. Трансгенных мух содержат при температуре 25 °C в пластиковых пробирках с кормом для мух и дополнительным сухим дрожжевым порошком сверху. Пробирку регулярно меняют каждые две-три недели в зависимости от условий выращивания.

Для приготовления корма для мух нагрейте соответствующее количество смеси для корма при постоянном перемешивании с помощью перистальтического насоса до растворения компонентов, затем распределите по 8–10 мл этой среды в виде суспензии в каждый пластиковый флакон. После того как суспензия корма застынет и остынет до комнатной температуры, закройте каждый флакон ватной пробкой. Поместите флаконы с кормом в лоток, запечатайте в пластиковом пакете и храните при температуре 4 °C для сбора яиц в малом масштабе.

Перенесите примерно 50 пар взрослых мух в возрасте двух-трех дней в новый флакон с кормом, на поверхность которого насыпали дополнительный сухой дрожжевой порошок для откладки эмбрионов. Инкубируйте при температуре 25 °C, которая в данном случае поддерживается кондиционированием воздуха в помещении. Каждый час переносите мух в новый флакон и оставляйте эмбрионы на 30 минут.

Чтобы гарантировать, что часть собранных эмбрионов находилась на стадии восьмого–десятого цикла ядерного деления, образцы, собранные в течение первого часа, обычно утилизируют, так как они часто содержат старые эмбрионы, которые оставались в организме самки в условиях, непригодных для откладки. Таким образом, в данных экспериментах будут использоваться только эмбрионы, перенесенные начиная со второго часа и далее.

Для данной процедуры используются предметные стекла и покровные стекла размером 50 на 22 миллиметра. Начните с того, что возьмите покровное стекло и с помощью влажной тонкой кисти слегка смочите четыре угла одной стороны очень небольшим количеством воды. Поместите покровное стекло на предметное стекло.

Капиллярное поверхностное натяжение, создаваемое тонкой жидкой пленкой, должно предотвратить смещение покровного стекла. Нанесите узкую полоску клея в гептане по центру покровного стекла. Гептан должен испариться за несколько секунд, оставив клей на покровном стекле.

Затем с помощью алмазного резца разрежьте еще одно покровное стекло на маленькие квадраты размером примерно 1,5 мм². Возьмите один такой квадрат и поместите его на один конец клейкой ленты. Он будет использоваться для вскрытия кончика иглы при необходимости проведения микроинъекции.

Возьмите еще один предметное стекло, прикрепите к нему отрезок двустороннего скотча длиной два сантиметра и снимите защитную бумагу, чтобы начать процедуру покрытия эмбрионов. С помощью влажной тонкой кисти перенесите мух в пробирку со свежим кормом. Перенесите около 50 яиц на двусторонний скотч на подготовленном предметном стекле.

Используйте подходящее количество жидкости, чтобы яйца распределились по поверхности. После испарения жидкости яйца прилипнут к ленте, что позволит рассмотреть их под диссекционном микроскопе. Осторожно несколько раз коснитесь яиц вдоль их продольной оси внешней стороной одной из половинок пинцета до тех пор, пока корион не будет прорван и открыт.

Оставьте эмбрион в оболочке Corian, чтобы предотвратить быстрое обезвоживание. Повторяйте этот процесс, пока не будет обработано от 10 до 20 яиц. Затем аккуратно извлеките эмбрионы из оболочек Corian по одному и осторожно поместите их в вертикальную полоску.

На клейкой полоске. Расположите эмбрионы так, чтобы их длинная сторона была антипараллельна длинной стороне клейкой полоски. Поместите эмбрионы в камеру для подсушивания на три-восемь минут.

Наконец, покройте эмбрионы соответствующим количеством масла Volter Left Tennis, чтобы предотвратить чрезмерное обезвоживание перед микроинъекцией. Микроинъекция является самым сложным этапом данной процедуры. Для того чтобы сделать процесс микроинъекции максимально простым и эффективным, необходимо строго следовать специальному протоколу подготовки скольжения.

Эмбрионы должны быть тщательно подготовлены, чтобы они находились в оптимальном состоянии для микроинъекций. Иглы для микроинъекций эмбрионов подготавливают заранее. Используя тонкий наконечник для загрузки, заполните иглу одним или двумя µL реагента соответствующей концентрации в инъекционном буфере.

Закрепите иглу в держателе игл на инвертированном конфокальном микроскопе Leica TCSP двухфотонного типа, подключив трубку подачи давления к системе управления инъекциями. Найдите эмбрион с помощью объектива с 40-кратным увеличением. Затем, не изменяя фокальную плоскость, найдите тень от иглы.

Это достигается путем перемещения иглы в центр поля зрения и её постепенного опускания до правой фокальной плоскости. Очень осторожно перемещайте предметный столик микроскопа, чтобы найти маленький квадрат покровного стекла, предварительно закрепленный на одном конце клейкой ленты. Очень осторожно перемещайте кончик иглы, пока он не коснется края маленького квадрата покровного стекла и аккуратно не разобьет его.

Переместите предметный столик так, чтобы эмбрионы снова появились в поле зрения, и выберите эмбрион подходящего возраста для инъекции. Осторожно переместите эмбрион ближе к игле и заново настройте фокальную плоскость как для эмбриона, так и для иглы. Введите иглу в эмбрион.

Введите каплю реагента в боковую часть эмбриона, затем уберите инструмент. Таймлапс-серии или одиночные изображения живых эмбрионов регистрируют с помощью системы инвертированного конфокального микроскопа Leica TCSS SP с использованием масляного иммерсионного объектива 40-кратного увеличения. При визуализации нескольких флуорофоров с перекрывающимися спектрами, которые коэкспрессируются в одном эмбрионе, длину волны испускания каждого флуоресцентного белка регистрируют последовательно.

Эти изображения появились позже, при настройке временных интервалов для таймлапс-съемки. Данные факторы необходимо учитывать. Как правило, одно изображение получается как среднее значение двух линий сканирования.

При среднем количестве сканирований в два кадра для сканирования изображения размером 512 на 512 пикселей требуется минимум 6,3 секунды в режиме одновременного сканирования и 15,44 секунды в режиме последовательного сканирования для получения хорошего отношения сигнал/шум. Диафрагма (пинхол) обычно устанавливается на 1–2 au (единицы Эйри), а мощность лазера регулируется до минимально возможного уровня, чтобы избежать значительного фотообесцвечивания. На этом репрезентативном таймлапс-видео показан динамический кинетический рекрутинг CDC 20 в ядро и движение хромосом в живых эмбрионах ophs in cial.

Изображения таймлапс-съемки были получены от трансгенного начального эмбриона, коэкспрессирующего G-F-P-C-D-C 20 (показан зеленым цветом) и RFP his stone two B (показан красным цветом). В течение циклов деления ядер каждые 10 секунд делали от семи до восьми кадров, при этом кадр, на котором клетки уже находились в профазе, принимался за нулевую точку времени. На данном рисунке представлены кадры из таймлапс-видео; G fp CDC 20 отчетливо наблюдается в кинетохорах в профазе и прометафазе, на что указывают белые стрелки на изображениях три и четыре соответственно, и сохраняется в кинетохорах в метафазе и анафазе, что видно на изображениях пять и шесть соответственно.

G-F-P-C-D-C 20 отсутствует в интерфазном ядре, указанном белой стрелкой на изображении один, и проникает в ядро к ранней профазе, как показано на изображении два. На изображениях с восьмого по четырнадцатый морфология хроматина была определена с использованием коэкспрессированного RFP гистона 2B в качестве совмещенных маркеров. Изображения представлены в нижнем ряду.

Используя данный протокол, можно изучать функции контрольной точки сборки веретена деления (SAC), воздействуя на эмбрионы путем микроинъекций антител, флуоресцентно меченных белков или интересующих химических соединений, способных активировать SAC. В данном примере эмбрионы обрабатывают колхицином для деполимеризации микротрубочек, что вызывает активацию SACG FP CDC 20 или GFP MAD. В качестве маркеров прохождения клеточного цикла использовались два кинетических основных сигнала.

На верхней панели ARES обозначают остановленные веретена деления на изображениях со второго по шестое. Область, отмеченная стрелкой на первом изображении, показывает состояние до обработки колхицином: G-F-P-C-D-C 20 исключен из ядра на поздней стадии интерфазы. Изображения на средней панели демонстрируют, что при отсутствии эндогенного MAD два G-F-P-C-D-C 20, отмеченные стрелками на изображениях с седьмого по двенадцатое, продолжают осциллировать, перемещаясь в ядро и из него, а также связываясь и диссоциируясь с кинетохорами.

Хотя цитокинез кажется нарушенным, это указывает на сбой функции SAC в остановке деления клеток в ответ на воздействие колхицина. Пример неудачного разделения дочерних ядер виден на изображении 10. Наконец, в нижней панели наконечники стрелок на изображениях с 14 по 18 указывают на покоящиеся кинетические ядра с накопленными слитыми белками GFP MA two, что говорит о том, что функциональный GFP MA two восстанавливает фенотип дефекта SAC в эмбрионе с мутацией MA two.

Стрелка на изображении 13 указывает на накопление GFP MAD 2 в ядре на поздней стадии интерфазы. После просмотра этих видео вы должны получить четкое представление о том, как собирать эмбрионы software из поддерживающих стеблей, вручную декоординировать эмбрионы перед подготовкой предметных стекол для микроинъекций и проводить прижизненный тайм-лапс имиджинг с использованием конфокальной микроскопии.