Упрощенная Техника

Сегодня мы демонстрируем упрощенный метод извлечения роговицы и отделения тканей сетчатки из глазного яблока человека, полученного от трупных доноров. Описанный метод позволит извлекать высококачественные ткани для трансплантации, хирургических целей и исследований в области офтальмологии, не повреждая при этом другие ткани глазного яблока. Обладая 18-летним опытом и проводя множество трансплантаций роговицы ежегодно, мы поддерживаем высокий стандарт нашей работы, разрабатывая новые методы и ежедневно совершенствуя свои навыки.

Для достижения этой цели мы сначала вырезаем роговицу, после чего следует эвисцерация сетчатки. Роговица представляет собой аваскулярную ткань, которая обеспечивает прохождение света к сетчатке и, в связи с этим, всегда должна сохранять высокую степень прозрачности. Роговица состоит из пяти слоев: эпителия, мембраны Боумена, стромы, мембраны Десме и эндотелия.

Если роговица повреждена, ее можно заменить с помощью подходящей донорской роговицы. Хориоидея представляет собой среднюю оболочку между склерой и сетчаткой, ограниченную изнутри мембраной Брусса, и отвечает за кровоснабжение глаза. Надлежащая эвисцерация хориоидеи так же важна, как и удаление сетчатки.

Сетчатка способствует восприятию света, проходящего через роговицу и хрусталик, и преобразует его в химическую энергию, которая в конечном итоге передается в мозг. Поскольку зрительный нерв прозрачен и хрупок, его следует удалять систематически для получения высококачественной ткани. Включите шкаф с ламинарным потоком воздуха.

Очистите ламинарный шкаф с помощью 70% изопропилового спирта. Наденьте средства индивидуальной защиты, такие как хирургический колпак, стерильные перчатки и бахилы. Используя технику асептики, подготовьте стерильную зону, разместив стерильную салфетку и предварительно стерилизованный лоток для инструментов.

Асептически откройте упаковку со стерильными инструментами и переложите их на стерильное поле, избегая любого загрязнения. Расположите все стерильные материалы и инструменты на стерильном поле, а банки с глазными яблоками разместите так, чтобы они находились по краю стерильного поля. Для удобства использования подпишите флаконы с заранее подготовленной средой для хранения, раствором полииодонного полиола, сульфатом натрия и стерильным фосфатно-солевым буферным раствором.

После извлечения из стерильного контейнера дождитесь, пока ткани глаза и растворы достигнут комнатной температуры, так как они хранятся в холодильнике при температуре 4 °C. Избегайте повторных циклов нагрева и охлаждения. С помощью стерильного пинцета удалите марлю и губки из банка с глазом.

Поместите глазное яблоко на крышку и снимите дополнительные повязки. Осторожно поднимите глазное яблоко вместе с зрительным нервом и погрузите его в стерильный раствор IPVP. Проведите дезинфекцию глазных яблок в стерильном IPVP в течение двух минут.

Перенесите глазное яблоко в стерильный раствор тиосульфата натрия на одну минуту. Затем перенесите глазные яблока в стерильный раствор фосфатно-солевого буфера для клеточных линий и оставьте до начала манипуляций. Работая под ламинарным потоком воздуха, промойте глазное яблоко, извлеките его из PBS и поместите в стерильную зону.

Оберните глазное яблоко стерильной салфеткой, оставив открытыми роговицу и примерно пять миллиметров склеры вокруг роговицы; при этом глазное яблоко можно просто удерживать в руке. Поддерживая достаточное давление, с помощью стерильных ножниц удалите все остатки конъюнктивы, не повреждая роговицу.

Используйте одноразовый скальпель, чтобы выполнить склеральный разрез на расстоянии трех-четырех миллиметров от области лимба. Затем расширьте разрез на 360 градусов, стараясь не перфорировать подлежащую сосудистую оболочку и не вызвать деформацию роговицы. Сохраняя нормальную кривизну, сделайте четыре больших разреза, оставив четыре небольших зазора, чтобы избежать вытекания стекловидного тела.

Вырезают все четыре сегмента, следя за тем, чтобы не удалить никакие другие ткани. Наличие небольших склеральных бляшек может затруднить процесс вырезания, поэтому убедитесь в полном иссечении склеры с помощью микрохирургических ножниц. Данную операцию следует выполнять, не повреждая хориоидею, сетчатку и стекловидное тело.

Осмотрите разрез, чтобы убедиться в его полноте. Если разрез выполнен правильно, краевая склера роговицы прикреплена к цилиарному телу только в точке, соответствующей роговице; поместите глазное яблоко ближе к центру стерильной салфетки. Завершите удаление роговицы с помощью стерильного пинцета.

Зафиксируйте склеральный край и вырежьте рогово-склеральный ободок, удаляя его от глазного яблока. Осторожно отделите любые оставшиеся прилегающие ткани от рогово-склерального фрагмента. Никогда не тяните рогово-склеральный край таким образом, чтобы вызвать поперечное натяжение роговицы, и не допускайте его падения обратно на переднюю камеру.

Плотность эндотелиальных клеток роговицы проверяют с помощью гипотонического раствора, а гибель клеток — путем окрашивания трипановым синим в течение примерно одной минуты. Удалите краситель трипановым синим стерильной марлевой салфеткой и промойте роговицу стерильным PBS. Перенесите ее в стерильную чашку Петри, заполненную раствором сахарозы.

Данный раствор способствует созданию гипотонической среды и облегчает визуальную идентификацию клеток. Затем клетки подсчитывают с помощью оптического микроскопа при стократном увеличении, выражая результат в количестве клеток на квадратный миллиметр. Обычно оценивают плотность расположения клеток и такие морфологические признаки, как межклеточные границы, полиморфизм, дегенерация, дистрофия и гибель клеток.

Толщина роговицы также является важным параметром для трансплантации, наряду с надлежащим уровнем прозрачности иссеченной роговицы. Стерильный зажим для роговицы используется для фиксации роговицы у края склеры; зажим изгибают так, чтобы обеспечить отверстие, достаточное для захвата склерального края. Затем с помощью зажима для роговицы склеральный край роговицы переносят в предварительно подготовленную среду для хранения роговицы, приготовленную при комнатной температуре. После этого роговицу следует хранить при 31 градусе SIU в течение четырехнедельного периода консервации.

Среда для хранения проходит несколько микробиологических тестов с использованием прибора B 9 2 4 0. Поскольку при хранении роговица становится толще обычного размера, необходимого для трансплантации, банки глаз используют противоотечные средства для уменьшения толщины. 6% Dextron T 500 используется для возвращения роговицы к нормальному размеру и транспортной среде.

Очистите стерильные инструменты с помощью средства для удаления РНК, чтобы создать среду, свободную от РНК, перед иссечением сетчатки. Подготовьте стерильную зону и убедитесь, что глазное яблоко не повреждено и удалены только роговица и склеральный край. Если стекловидное тело вытекает, удаление тканей сетчатки затрудняется.

Если возраст донора составляет менее 65 лет, после серологического тестирования склера сохраняется в 70% алкоголе для хирургических целей. В таких случаях склера не разрезается; удаляется только стекловидное тело, а вся склера сохраняется для эксцизии сетчатки. Начните с небольшого надреза или разреза со стороны роговицы склеры, продвигаясь в сторону зрительного нерва с помощью стерильных пинцетов и ножниц.

Удерживая часть склеры стерильным пинцетом, последовательно разрезайте ее ножницами по прямой линии в направлении зрительного нерва, стараясь не повредить стекловидное тело. Хориоидальные пробки следует отделять от склеры, так как они плотно прилегают друг к другу. Удалите всю склеру, чтобы обнажить ткань хориоидеи.

После полного разреза склеры отделите ее от остальных тканей, сделав разрез рядом с зрительным нервом; теперь станет виден весь слой хориоидеи, покрывающий стекловидное тело. С помощью двух стерильных пинцетов перенесите эти ткани в стерильные пробирки, свободные от РНКаз, предварительно наполнив их 2 мл раствора Рингера-Лактата (RL). Аккуратно удалите слой хориоидеи, зафиксировав зрительный нерв одним пинцетом и снимая хориоидею другим.

Частично отделите хориоидею и разрежьте ее, чтобы облегчить удаление. Слой хориоидеи можно разрезать ножницами, избегая повреждения сетчатки. Поместите иссеченный слой хориоидеи в раствор RNA later и храните при температуре 4 °C в течение 24 часов.

Удалите все остатки хориоидеи, чтобы обнажить ткани сетчатки. После полного удаления слоя хориоидеи станет виден прозрачный слой сетчатки. Очевидно, что слой хориоидеи имеет внутреннюю мембрану Бруха, которую также можно удалить, однако ее трудно идентифицировать невооруженным глазом.

Аналогичным образом, используя два пинцета, удалите слой сетчатки. Большое количество сетчатки легче изолировать, если проводить иссечение рядом с зрительным нервом. Теперь стали видны все слои глаза.

Поместите иссеченную сетчатку в раствор RNA later и храните ее при температуре 4 °C в течение 24 часов. Очистите рабочую область 70% изопропиловым спиртом. Эндотелиальные клетки, окрашенные трипан синим, можно рассмотреть под инвертированным микроскопом с 100-кратным увеличением.

Для дальнейшего использования обычно сохраняют подходящую роговицу, содержащую более 200 клеток на квадратный миллиметр. Оценка их качества по шкале от удовлетворительного до отличного поможет при проведении сравнительных исследований. Как правило, когда роговица готова к трансплантации, фиксируют её толщину и прозрачность, после чего подходящая роговица используется для пенетрации кератопластики, при которой трансплантируется вся роговица.

Жизнеспособность клеток проверяют путем визуального определения окрашенных в синий цвет клеток; результат выражается в процентах погибших клеток. Общий уровень гибели клеток более 2% считается недопустимым при консервации. Если плотность клеток ниже 2200 клеток на квадратный миллиметр или имеются повреждения вследствие гибели клеток, роговица может быть использована для передней ламеллярной кератопластики.

Если передний сегмент поврежден, а роговица имеет достаточную плотность эндотелиальных клеток, такую роговицу можно использовать для задней ламеллярной кератопластики. Во время культивирования органа толщина роговицы обычно увеличивается. Транспортная среда способствует восстановлению ее нормальной формы и структуры.

Кроме того, культивирование органов способствует реэпителизации роговицы и, благодаря длительному периоду хранения, облегчает правильный подбор донора. Проводятся микробиологический и серологический анализы. Это дает достаточно времени для организации операции и позволяет проверить плотность и морфологию эндотелиальных клеток в случаях, когда это невозможно из-за большого времени, прошедшего с момента смерти.

Таким образом, при соблюдении описанной процедуры роговицы можно извлечь без повреждения других тканей. Если роговица не подходит для трансплантации, ее можно использовать в исследовательских целях для разработки новых сред и условий консервации, изучения заболеваний поверхности глаза, выделения стволовых клеток лимба и изучения воздействия лекарственных средств на роговицу. Что касается сетчатки, мы можем избежать перекрестного загрязнения образцов РНК тканями центральной части глаза и сохранить целостность РНК, что имеет принципиальное значение.

Эти ткани, незаменимые для исследовательских целей, предназначены для характеристики транскриптома тканей глаза, выделения стволовых клеток для проектов в области регенеративной медицины и оценки гистологических различий между тканями здоровых и больных субъектов. После извлечения ткани сетчатки их можно использовать для различных целей, поэтому последующие этапы и условия консервации могут отличаться соответственно. Например, ткани сетчатки можно поместить в пробирки, содержащие реагенты для стабилизации РНК, такие как r nator или буфер thisis для экстракции РНК или ДНК, либо в раствор дисплазе или трипсина для выделения клеток.

Фиксирующие растворы, используемые перед заливкой тканей в парафин или OCT для иммуногистохимического анализа. Спасибо за просмотр этого видео и удачи в ваших исследованиях.