GC на основе обнаружения Aldononitrile ацетат производные кислоты и глюкозамина мурамовой для определения микробной остатков в почве

Общая цель данного видео — предоставить детальное описание анализа производных нитрил-ацетата Алдона глюкозамина и муковой кислоты, экстрагированных из почв, с помощью ГХ. Процесс начинается с кислотного гидролиза, в ходе которого происходит расщепление органических полимеров и высвобождение глюкозамина и муковой кислоты. Затем мономеры аминосахаров выделяют и очищают из смеси растворов.

Затем проводится дериватизация для преобразования этих аминосахаров в летучие ацетаты альдоннитрилов для анализа методом газовой хроматографии. Заключительным этапом процедуры являются жидкостно-жидкостная экстракция и определение с помощью ГХ. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие базовое разделение ацетатов альдоннитрильных аминосахаров, выходящих в интервале между стандартами мио-инозитола, ацетола и метилглутамина при проведении ГХ с пламенно-ионизационным детектированием.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с другими подходами является оптимальный баланс точности, чувствительности, простоты, качественного хроматографического разделения и стабильности при хранении образцов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области глобального цикла углерода, такие как вклад микроорганизмов SSE в пулы стабильного почвенного углерода. Хотя данный метод позволяет получить представление и информацию о накоплении микробного детрита в почвах, его также можно применять к другим матрицам, таким как океанические системы, биологические ткани и даже внеземные образцы.

Для начала данного протокола подвергните образцы почвы лиофилизации после сбора в полевых условиях, затем измельчите и гомогенизируйте их с помощью шаровой мельницы или ступки с пестиком. Взвесьте измельченные образцы почвы в колбах для гидролиза объемом 25 мл. Добавьте в каждую колбу 10 мл 6 M соляной кислоты и заполните ее азотом перед плотным закрытием крышкой.

Проведите гидролиз при 105 °C в инкубаторе в течение восьми часов. С помощью автоматического таймера извлеките колбы из инкубатора и охладите до комнатной температуры.

Добавьте 100 µL внутреннего стандарта мио-ацетола в каждую колбу. Перемешайте круговыми движениями. Установите пластиковые воронки, сливающиеся в грушевидные колбы объемом 200 mL. Используйте шлифованные стеклянные соединения стандартного конуса размера 24 40, установив их на пластиковые стаканы для устойчивости.

Сложите качественные фильтровальные круги Whatman № 2 вчетверо и установите их в воронки. Встряхните каждую колбу для гидролиза круговыми движениями и перелейте суспензию в воронку. Для фильтрации каждого образца высушите фильтрат с помощью роторного испарителя при температуре примерно 45 °C, используя вакуум.

Растворите высушенный остаток из каждой колбы в 3–5 мл воды и перенесите в тефлоновую пробирку объемом 40 мл. Промойте каждую колбу второй порцией воды. Доведите pH образцов до 6,6–6,8, используя 1 M раствор гидроксида калия, чтобы осадить ионы металлов и другие органические молекулы. Затем удалите осадок путем центрифугирования при 2000 ×g в течение 10 минут.

Перелейте супернатанты в стеклянные пробирки объемом 40 миллилитров и закройте отверстия пробирок парафильмом; заморозьте супернатанты, после чего проделайте отверстия в парафильме. Лиофилизируйте замороженные супернатанты для полного удаления жидкости. После высушивания супернатантов растворите остаток в трех миллилитрах сухого метанола.

После тщательного перемешивания на вортексе плотно закройте пробирки крышками, а затем центрифугируйте при 2000 ×g в течение 10 минут. Для осаждения солей перенесите супернатанты в конические реакционные флаконы объемом 3 мл и выпарите досуха на экспресс-вакуум-испарителе при 45 °C или под слабым током сухого азота. После выпаривания добавьте в каждый флакон 100 µL восстанавливающего стандарта и метилглутамина, а также 1 мл воды.

Затем заморозьте образцы перед началом дериватизации. Приготовьте стандартные образцы согласно письменному протоколу, после чего подвергните лиофилизации как исследуемые образцы, так и стандарт. Приготовьте реагент для дериватизации, содержащий 32 mg/mL гидрохлорида гидроксиламина и 40 mg/mL.

Раствор диметиламинопурина в метаноле. Добавьте 300 µL реагента для дериватизации в каждую из реакционных пробирок, плотно закройте крышки и тщательно перемешайте на вортексе. Поместите закрытые пробирки в водяную баню при температуре от 75 до 80 °C на 35 минут.

Извлеките флаконы из водяной бани и охладите до комнатной температуры. Затем добавьте один миллилитр уксусного ангидрида в каждый из трехмиллилитровых реакционных флаконов, плотно закройте крышками и тщательно перемешайте на вортексе. После этого проведите вторую инкубацию в водяной бане при температуре от 75 до 80 °C в течение 25 минут.

Извлеките пробирки из водяной бани и охладите до комнатной температуры. Для начала разделения и измерения добавьте в каждую пробирку 1,5 milliliters дихлорметана, затем перемешайте на вортексе. После добавления в каждую пробирку 1 milliliter 1 molar соляной кислоты и тщательного перемешивания на вортексе оставьте растворы в покое до разделения на две фазы.

Отоспирируйте и удалите верхнюю водную фазу. Аналогичным образом, используя дозатор на 1000 мкл, трижды извлеките органическую фазу, при этом на последнем этапе промывки используйте 1 мл воды. Убедитесь, что вся верхняя водная фаза была полностью удалена.

Высушите конечный раствор с помощью быстрого испарителя (VAP) при 45 °C или потоком газообразного азота, растворите каждую пробу в 300 µL смеси этилацетата и гексана, перенесите в янтарные виалы объемом 2 мл с винтовой крышкой и вставкой для малых объемов и плотно закройте для количественного анализа методом газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектором, используя неполярную капиллярную колонку из кварцевого стекла (например, DB-5), как указано в письменном протоколе. После стандартного запуска и анализа отрегулируйте скорость потока газа-носителя так, чтобы производные ацетолглюкозамина и муамовой кислоты элюировались при 250 °C, а N-метилглутамин — при 270 °C.

После завершения газохроматографического анализа выполните инъекцию 1 µL с делением потока 30:1 при температуре инжектора ГХ 250 °C с использованием автосамплера. В качестве заключительного этапа данной процедуры проведите валидацию производных с помощью методов хроматографии и спектрометрии, описанных в письменном протоколе. Здесь представлены примеры анализа глюкозамина и мочевой кислоты в стандартных образцах и в пробе почвы; помимо глюкозамина и муковой кислоты, с помощью данного метода можно одновременно определить два изомера глюкозамина — осамин и галактозамин, основываясь на точном количестве внесенных стандартов и коэффициентах отклика для каждого из двух внутренних стандартов.

Можно определить количество этих биомаркеров в образцах почвы. Стандарт восстановления также использовался для качественного мониторинга процесса дериватизации. Здесь представлены схемы образования ацетата альдоннитрила, деривата глюкозамина и муковой кислоты.

Цифрой один обозначена реакция нитрилирования, а цифрой два — ацетилирование. Предложенные структуры ионных фрагментов, образующихся при электронной ионизации, были изучены путем сравнения ионных спектров образцов, подготовленных с использованием различных изотопных меток. Здесь показано смещение массы доминирующего иона производного альдоннитрил-ацетата глюкозамина при различных сценариях.

В данном примере препараты были подготовлены с использованием как немаркированных реагентов, так и изотопно-маркированного уксусного ангидрида и изотопно-маркированного глюкозамина. Звездочка на химической структуре обозначает атом тяжелого изотопа или изотопную группу. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости строгого соблюдения безводных условий в процессе дериватизации.

Как органические растворители, так и используемая на этом этапе стеклянная посуда должны быть сухими. Хотя многие поставщики продают безводные растворители, имеющиеся в наличии можно высушить, пропустив их через колонки с осушающими реагентами, такими как сульфат магния. После выполнения этой процедуры могут быть применены другие методы, такие как изотопная масс-спектрометрия, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, о том, как реагирует макрофауна, как происходит оборот и накопление углерода или азота в почвах, путем дифференциации живых и мертвых макроорганизмов после их развития.

Эта методика открыла исследователям в области макроэкологии, биологии и химии почв возможность изучить вклад макроорганизмов в формирование органического вещества почвы и его секвестрацию в природных или управляемых наземных системах.