Преодоление невосприимчивости в экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) штаммов мыши по усыновлению и передачи Антигенная вызов

Общая цель данной процедуры — стабильное и простое индуцирование ЭАЭ у мышей любой линии, включая те, которые считаются резистентными к индуцированию ЭАЭ. Это достигается путем первоначальной иммунизации мышей-доноров специфическими белками миелина или пептидными антигенами, эмульгированными в полном адъюванте Фрейнда. Через 10 дней лимфатические узлы мышей-доноров изолируют, а клетки лимфатических узлов повторно стимулируют in vitro путем культивирования с тем же антигеном в течение четырех-пяти дней.

Затем клетки адаптивно переносят наивным мышам-реципиентам. У восприимчивых линий мышей ЭЭР развивается в течение 8–14 дней; для запуска ЭЭР у резистентной линии через 14 дней после адаптивного переноса мышей-реципиентов иммунизируют антигеном в CFA.

С помощью данного метода можно индуцировать EAE у резистентных линий мышей. Основным преимуществом протокола адаптивного переноса и стимуляции для индуцирования EAE является возможность надежного развития заболевания. Случаи, когда клинические проявления болезни наблюдались менее чем у 100% животных, встречаются крайне редко.

Мы можем адаптировать данный протокол для индукции заболевания у восприимчивых линий мышей, но что более важно, этот протокол позволяет индуцировать ЭАЭ у многих линий мышей, которые ранее считались резистентными к заболеванию. Демонстрацию процедур проведет наш ведущий научный сотрудник, Ча Чинг.

Начните с приготовления раствора MBP в PBS в концентрации 2 mg/mL. Используйте шприц с матовым стеклом и системой Luer-Lock, чтобы набрать по 100 µL раствора антигена на каждую мышь, подлежащую иммунизации.

С помощью отдельного шприца наберите равный объем полного адъюванта Фрейнда H 37 ra. Затем с помощью трехходового крана соедините два шприца и перемещайте поршни вперед и назад, чтобы смешать антиген и адъювант до образования эмульсии. Чтобы убедиться в этом, перенесите раствор в один из шприцев и отсоедините пустой.

Слегка оттяните поршень пустых шприцев назад, затем вытесните каплю остатка смеси в стакан с чистой водой комнатной температуры. Если капля распадается, снова соедините шприцы и продолжайте перемешивание. Если капля остается целой, что свидетельствует об образовании эмульсии, повторите тест, чтобы собрать полученную эмульсию.

Для иммунизации. Соедините пластиковый шприц объемом 1 мл со стеклянным шприцем, из которого извлечен поршень. Осторожно перенесите раствор в пластиковый шприц, заполнив его до края.

Затем вставьте пластиковый плунжер и выдавите часть эмульсии так, чтобы осталось ровно 1.2 milliliters. В шприце не должно быть пузырьков воздуха. При правильном выполнении данной процедуры.

Отсоедините пластиковый шприц. Установите иглу калибра 26 G и заполните мертвый объем иглы, нажав на поршень до отметки 1 мл. Крепко зафиксируйте мышь (скрутите в скатке) и отведите хвост назад, зажав его между безымянным пальцем и мизинцем, чтобы грудная клетка и брюшная полость были легко доступны. Подкожно.

Введите 50 µL эмульсии в область грудной клетки сразу над правым подмышечником. При правильном введении в месте инъекции будет виден небольшой белый бугорок. Повторите процедуру над левым подмышечником, затем отпустите хвост и зафиксируйте правую лапу, открывая правый бок мыши.

Введите 50 µL раствора чуть ниже грудной клетки. Отпустите правую лапу. Поверните мышь в другую сторону и повторите инъекцию с левой стороны.

Через семь-десять дней после иммунизации изымают лимфатические узлы у эвтаназированных животных. Сначала мышь помещают на спину, разводя конечности и закрепляя их булавками к препарировочной доске.

Опрыскайте мышь этанолом. Затем, используя стерильные инструменты, сделайте продольный разрез кожи мыши от нижней части живота до подбородка.

Сделайте еще один разрез от брюшной полости вниз по одной конечности, затем — по другой. Снимите кожу с мыши и закрепите ее булавками на препаровочной доске.

Также сделайте надрезы кожи вдоль четырех конечностей. Затем отслоите и закрепите верхнюю часть кожных лоскутов булавками по обеим сторонам; паховые и подмышечные лимфатические узлы, которые обычно расположены близко к паху или подмышкам, должны быть видны в виде небольших непрозрачных масс непосредственно под кожей. С помощью двух тонких пинцетов осторожно удалите соединительную ткань над первым лимфатическим узлом.

Следите за тем, чтобы в процессе не повредить кровеносные сосуды. После удаления соединительной ткани поместите один пинцет под лимфатический узел и отделите его от тела. Перенесите лимфатический узел в чашку Петри диаметром 35 millimeter с оригинальным стерильным PBS и аналогичным образом извлеките остальные три лимфатических узла.

После сбора всех лимфатических узлов перенесите чашку Петри в бокс биологической безопасности. Используя тыльную сторону поршня стерильного шприца, гомогенизируйте лимфатические узлы для высвобождения клеток, затем, чтобы удалить клеточный дебрис, профильтруйте суспензию через нейлоновую сетку в коническую пробирку.

Затем доведите объем до 50 миллилитров стерильным PBS и центрифугируйте клетки в течение 10 минут. После центрифугирования ресуспендируйте клетки в небольшом объеме предварительно прогретой среды для культивирования клеток и подсчитайте количество жизнеспособных клеток. Доведите концентрацию до 4 × 10⁶ клеток на миллилитр.

Затем высейте клетки в 24-луночный планшет из расчета 2 мл на лунку. В каждую лунку добавьте антиген MVP до достижения конечной концентрации 100 µg/mL. После добавления антигена.

Инкубируйте клетки при 37 °C в течение пяти дней. После повторной стимуляции клеток соберите их, аккуратно перенося пипеткой вверх и вниз, и перенесите в коническую пробирку объемом 50 мл. Центрифугируйте клетки при 1000 об/мин в течение 10 минут и ресуспендируйте осадок в небольшом объеме стерильного PBS.

Затем подсчитайте количество клеток и доведите концентрацию жизнеспособных клеток до 2,5 × 10⁸ клеток на мл с помощью PBS. Наберите клетки в шприц, оснащенный иглой 26 G, для проведения адаптивного переноса. Введите 0,2 мл клеток внутривенно в хвост каждой мыши, чтобы вызвать заболевание у резистентных мышей через две недели после адаптивного переноса.

Введите животным 200 µg антигена в объеме 200 µL эмульсии тем же способом, которым проводилась иммунизация мышей-доноров. Через 7–10 дней после воздействия разовьется паралитическое заболевание, прогрессирование которого можно будет отслеживать. Болезнь начинается со слабости в хвосте.

При вялости хвоста заболеванию присваивается первая степень. Вторая степень присваивается, если у мыши развивается паралич одной задней конечности, и третья — если парализованы обе задние конечности. Четвертая степень характеризуется параличом обеих передних конечностей.

Пятая степень характеризуется более выраженным поражением мыши. Шестая степень означает гибель животного. Как показано здесь, через 7–14 дней после индукции у мышей развивается монофазное паралитическое заболевание, степень тяжести которого оценивается по классическим критериям ЭАЭ.

Хотя мыши могут выздороветь, спонтанного рецидива заболевания не произойдет. Индукция болезни требует специфического воздействия антигена. Воздействие только CFA или постороннего антигена не вызывает развития заболевания.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о методе адаптивного переноса и последующего воздействия (challenge) для индуцирования ЭАЭ. Сочетая адаптивный перенос клеток лимфатических узлов, специфичных к антигену, с повторным воздействием антигена, можно легко индуцировать ЭАЭ у любой линии мышей. Этот метод позволяет преодолеть механизмы резистентности, присущие некоторым линиям мышей, и, следовательно, дает возможность изучать устойчивость к заболеванию. Также.

Данный метод можно легко адаптировать для изучения любого процесса аутоиммунного заболевания.