Простой микрофлюидных устройства для

Здравствуйте, меня зовут Шамал, я постдокторант в группе TUR Kika в Национальном центре биологических наук Индии. В этом видео я покажу вам, как изготовить биочип-микроустройство с помощью методов мягкой литографии в условиях обычной лаборатории. Я буду использовать эти устройства для получения изображений генетических модельных организмов с высоким разрешением на клеточном и субклеточном уровнях.

Данный протокол позволит исследователям проводить такую таймлапс-визуализацию на целых организмах без использования анестезии. Итак, приступим. Мы разработали простое микрофоническое устройство для проведения визуализации in vivo без анестезии генетических модельных организмов, таких как C. elegans, целые особи Danio rerio и личинки зебраниок.

В данном исследовании мы демонстрируем устройство для четкой иммобилизации на основе мембраны, изготовленное с помощью мягкого формования PDMS. Для иммобилизации отдельного организма мы находим животное под стереомикроскопом, захватываем его с помощью небольшой капли буферного раствора с использованием микропипетки, помещаем отдельное животное в проточный канал и иммобилизируем его под мембраной PTMS. Для этого используется соединение с азотом под давлением через трехходовой шаровой кран.

Спроектируйте микрофлюидные структуры с помощью специализированного программного обеспечения. Очистите кремниевые пластины размером 2 см на 2 см в 20% KOH в течение одной минуты и промойте дистиллированной водой. Просушите образцы потоком азота и дегидратируйте при 120 °C в течение четырех часов.

Нанесите Spinco hexa metal на кремниевые пластины методом центрифугирования при 500 RPM в течение пяти секунд и при 3000 RPM в течение 30 секунд. Нанесите Spinco SU 8 2 0 2 5 на кремниевые пластины методом центрифугирования при 500 RPM в течение пяти секунд и при 2000 RPM в течение 30 секунд. Проведите мягкий обжиг покрытых кремниевых пластин при 65 °C в течение одной минуты и при 95 °C в течение 10 минут.

Облучите запеченные пластины с покрытием из SU-8 с помощью УФ-лампы мощностью 200 Вт через фотошаблоны для первого и второго дизайнов, соответствующих потоковому и контрольному слоям соответственно. Проведите дозапекание пластин при температуре 65 °C в течение одной минуты и при 95 °C в течение 10 минут. Проявите образцы с использованием раствора проявителя SUA в течение 20 минут.

Обработайте детали парами трихлоперфторциклооктена в эксикаторе в течение двух часов. Смешайте основу poly dyl xox и отвердитель в весовом соотношении 10:1. Дегазируйте смесь для удаления всех пузырьков воздуха, образовавшихся во время перемешивания.

Налейте смесь PDMS слоем толщиной 5 мм на кремниевые пластины с нанесенным весовым шаблоном конструкции SC. Делайте это осторожно, чтобы избежать образования пузырьков воздуха. Нанесите PDMS на кремниевые пластины методом центрифугирования для создания равномерного слоя, предназначенного для потокового слоя: сначала при 500 RPM в течение 5 секунд, затем при 1500 RPM в течение 30 секунд.

Прокалите оба образца первой и второй конструкции, содержащие PDMS, при 50 °C в течение шести часов. Вырежьте фрагмент PDMS из кремниевой подложки, используя лезвие с шаблоном SCH 2. Проколите небольшое отверстие в верхней части резервуара, соединяющего основную ловушку в форме из PDMS.

Используя иглу самого большого диаметра или иглу 18G, подвергните нижнюю поверхность управляющего слоя и верхнюю поверхность потокового слоя воздействию воздушной плазмы мощностью 18 Вт в течение двух минут. Соедините две поверхности, обработанные плазмой, прикладывая легкое давление, и выдержите их при температуре 50 °C в течение двух часов.

Вырежьте присоединенные устройства из кремниевой подложки с помощью конструкции SUH один и проделайте отверстия для доступа в приемнике и выпускнике проточного канала. Откройте нижнюю сторону PD устройства и очистите стеклянную крышку. Обработайте воздушной плазмой при 18 вольтах в течение двух минут.

Аккуратно прижмите две поверхности, обработанные плазмой, и выдержите при температуре 50 °C в течение двух часов. Храните устройство в чистой среде до дальнейшего использования. После изготовления устройств я покажу вам, как использовать мембрану из PDMS для иммобилизации c. elegans в устройстве. Подключите один конец микрогибкой трубки к регулятору подачи сжатого азота, а другой конец — к основному резервуару ловушки через иглу калибра 18G.

Трехходовой кран, установленный посередине трубки, позволяет подавать или сбрасывать давление на мембрану. Заполните трубку, подходящую к устройству из PDMS, колонкой дистиллированной воды длиной 10 сантиметров перед ее подключением к резервуару основной ловушки. Откройте вентиль подачи азота до достижения значения PSI для белка и под малым увеличением инвертированного микроскопа проконтролируйте отклонение мембраны основной ловушки в сторону проточного канала.

Освободите трехходовой кран и переведите мембрану в положение покоя. Заполните проточный канал буфером в течение 10 минут. Перед началом эксперимента найдите одну особь *S. elegans*, используя стереомикроскоп с низким увеличением.

С помощью микропипетки с небольшим объемом буферного раствора захватите одну особь животного. Протолкните ее через входной канал потока. Отрегулируйте давление при пипетировании, чтобы переместить отдельное животное под основную ловушку.

Медленно увеличивайте давление на мембрану из PDMS, чтобы прижать животное к границе канала и иммобилизовать его при давлении от 7 до 14 PSI. Используйте инвертированный микроскоп с необходимыми настройками для получения изображений высокого разрешения в светлом поле или при флуоресцентной визуализации. Получайте одиночные или временные серии флуоресцентных изображений с заданной частотой кадров в реальном времени.

Сбросьте давление в ловушке и пронаблюдайте за локомоторным поведением животного. В течение пяти минут при малом увеличении промойте камеру и поместите новое животное. Для повторения этапов DevOp используйте срезанный наконечник микропипетки, чтобы захватить одну личинку oph и поместить ее в микроферритное устройство большего размера.

Пропустите одну личинку через входной канал потока. Медленно увеличьте давление на мембрану из PDMS и иммобилизуйте личинку при давлении ESI семь. Используйте инвертированный микроскоп для флуоресцентной визуализации при малом увеличении, снимая серию флуоресцентных изображений с интервалом по времени (time-lapse) для визуализации транспорта.

Сбросьте давление в ловушке и при малом увеличении проследите за локомоторной активностью личинки. Используйте тот же принцип работы устройства для иммобилизации и получения изображений с интервалом времени (time lapse) 30-часовых после оплодотворения эмбрионов рыбки зебра (zebrafish). Val heart.

После просмотра этого видео вы сможете изготовить аналогичные микроустройства в собственной лаборатории и успешно использовать их для иммобилизации организмов при проведении высокоразрешающих экспериментов. Благодарим за просмотр видео и желаем удачи в ваших исследованиях.