Выносливость протокол Обучение и продольные анализы производительности для дрозофилы MELANOGASTER

Целью следующего эксперимента является тренировка Dsof и Melanogaster с использованием новой программы упражнений на выносливость и оценка эффектов таких тренировок. Это достигается с помощью автоматизированного устройства, которое многократно поднимает и опускает несколько пробирок с мухами, активируя их инстинктивную реакцию подъема и тем самым обеспечивая мухам тренировочную сессию. Мухи тренируются ежедневно по ступенчатому графику продолжительностью от двух до трех часов в течение трехнедельного периода тренировок.

Затем мухи подвергаются различным поведенческим тестам для оценки эффектов физических нагрузок. Результаты показывают, что мухи, подвергавшиеся нагрузкам, поднимаются быстрее, что измеряется с помощью теста с быстро индуцированным отрицательным геотаксисом или кольцевого теста. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими способами, такими как тренировки на выносливость у других животных, является широкий набор доступных инструментов для генетических манипуляций с drosophila.

При изучении выносливости при физических нагрузках идея данного метода возникла у нас в ходе проведения многочисленных тестов на отрицательный геотаксис. Мы задались вопросом, как долго мухи могут продолжать подниматься и можно ли таким образом тренировать их выносливость. «Башня силы» (power tower) установлена на прямоугольном листе фанеры, который зафиксирован зажимами на столе.

Скорость вращения составляет 4.5 об/мин. Редукторный двигатель установлен на нескольких досках и подключен к регулятору скорости, предохранителю и выключателю питания. В распределительной коробке установлен вентилятор диаметром три дюйма в металлической трубке, который направлен на двигатель для охлаждения.

К двигателю подключен вращающийся рычаг с роликом. При работе двигателя и рычага происходит вращение, в результате которого прижимается один конец изогнутого стержня, закрепленного на фанере. С другой стороны стержня установлен дверной шарнир, к которому прикреплено колесо, позволяющее стержню катиться по платформе.

При вращении двигателя платформа перемещается вверх и вниз; мощность двигателя отрегулирована таким образом, чтобы полный период вращения составлял 15 секунд. На платформе с помощью эластичных шнуров закреплены штативы с флаконами для мух, а сами флаконы в этих штативах зафиксированы сеткой, которая также прикреплена к платформе. Благодаря эластичным шнурам платформа может скользить вверх и вниз по стандартным выдвижным направляющим, а пенопластовая подушка смягчает удар при ее опускании. Установка «power tower» эксплуатируется в помещении с регулируемой температурой, соответствующей условиям содержания животных.

Для проведения эксперимента по физическим нагрузкам требуется минимум 240 самцов мух одного возраста для лонгитюдного мониторинга выносливости и способности к перемещению по отрицательной геооси (способности к лазанию). Содержите мух в популяциях по 20 особей в одном флаконе. Разделите флаконы на две равные группы: одна группа будет подвергаться физическим нагрузкам, флаконы этой группы следует закрыть пробками-флагами (flugs), а контрольная группа должна быть закрыта губчатыми пробками.

Для иммобилизации используется губка, поскольку ее адаптивный размер позволяет легко разместить ее у дна флакона. Более мягкий материал губки также снижает вероятность травм, которые могут быть вызваны более твердыми пробками. Флаконы с кормом следует заменять раз в два дня перед началом тестирования.

Во время обучения мухи остаются в флаконах с кормом, так как при использовании пустых флаконов значительно увеличивается число травм у мух, связанных с процессом обучения. При установке флаконов с контрольными мухами на силовую башню прижмите губчатые пробки примерно на три миллиметра выше уровня корма, тем самым ограничивая перемещение мух.

Движение для получения стабильных результатов. Тестируйте обе группы мух по пять дней подряд в неделю, используя график с постепенным увеличением продолжительности каждой сессии с двух до трех часов в день в течение трехнедельного периода. Разумеется, может быть применен любой другой режим.

Важным условием является соблюдение единообразия в методах обработки, времени суток и способах проведения анализа на протяжении трехнедельного периода. Тщательное планирование и отработка процедур снижают вероятность ошибок, связанных с утомлением. Анализы могут проводиться лонгитюдно: до, после или во время режима тренировок мух.

Этот метод также может быть использован для оценки более безопасного отклика на переменную окружающей среды. Проводите анализ на утомляемость в день, когда не запланированы тренировки. В начале дня поместите обе группы мух в установку Power Tower.

Включите аппарат и проверяйте каждую пробирку каждые 10 минут. Если в течение четырех последовательных контролей пять или менее мух в пробирке поднимаются выше чем на два дюйма, данная когорта мух считается утомленной. Извлеките утомленных мух из установки («power tower») во время ее работы и зафиксируйте время извлечения.

Наблюдайте за всеми флаконами в течение максимум 10 часов и зафиксируйте результаты. Один анализ для количественного определения. Эффекты тренировки оцениваются путем ежедневного измерения скорости бега, которое может проводиться на протяжении всего режима тренировок и после его завершения.

Для измерения долгосрочного эффекта тренировки. Чтобы начать тест на скорость лазания или кольцевой тест, сначала перенесите мух в новые пустые пробирки и поместите ряд из шести пробирок в штатив. Для закрепления пробирок в штативе используются свернутые кусочки скотча.

Затем поместите штатив перед источником света, например, перед рентгеновским негатоскопом, который обеспечит равномерное освещение пробирок. Теперь установите камеру для фотографирования штатива таким образом, чтобы в каждой пробирке было видно положение каждой мухи. Затем постучите по шести пробиркам, чтобы все мухи упали на дно, и сделайте фотографию с фиксацией времени.

Спустя две секунды после того, как все мухи будут сбиты. Если используется вспышка камеры, ее следует использовать постоянно. Повторите этот процесс четыре раза для каждого набора виалов, прежде чем переходить к работе с электроустановкой (power tower).

Для анализа данных обработайте каждое фото индивидуально с помощью программного обеспечения, чтобы определить верхнюю и нижнюю границы пробирки. Затем измерьте высоту подъема для каждой мухи. После этого скопируйте значения высоты подъема в Excel.

Каждой мухе в каждом флаконе присваивается балл от нуля до четырех, соответствующий высоте квадранта. Если муха поднимается в самый верхний квадрант, ей присваивается четыре балла, а если не поднимается вовсе — ноль. Для каждого флакона рассчитайте баллы для каждой из 20 мух и определите средний балл когорты.

Этот показатель называется индексом лазания. Для анализа данных используется среднее значение четырех индексов лазания каждой когорты за этот день. Если программное обеспечение для обработки изображений недоступно, на пустых флаконах можно нарисовать линии квадрантов, а мухам вручную присвоить значения квадрантов, в то время как мухи определенного типа реагировали на протокол выносливости с менее выраженным возрастным снижением способности к лазанию.

Этот эффект сохранялся и после завершения тренировок, что подтверждалось лонгитюдными тестами в кольце в течение пяти недель жизни. Таким образом, стимуляция физической активности с помощью программы «power tower» может быть использована в качестве поведенческого воздействия, что позволяет оценить способность генетических или средовых факторов модулировать этот эффект. И наоборот, «power tower» может быть использован и в качестве измеряемого результата.

Например, при тестировании времени до наступления утомления у мух с различным процентным содержанием сахарозы в рационе повышенное содержание сахарозы коррелировало с увеличением выносливости. При выполнении данной процедуры важно следить за тем, чтобы все когорты мух были одного возраста, а методы применялись единообразно на протяжении всего эксперимента.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить тренировку на выносливость и оценивать выносливость мух любого генотипа.